00mg/L+Cef 300mg/L)中 生根壮苗。最后移栽至钵内，在温室内生长发育。植物激素6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，NAA为萘 乙酸，MS基本培养基配方见文献（Murashige T，Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.Physiol Plant,1962,15(3): 473-497)。利用Kan抗生素筛选转化烟草植株，并且利用PCR分析确定EsMYBFl基因整合到转 基因烟草基因组中。最后，获得了3个表型明显的独立的转基因烟草T 2代株系作为后续分析 的材料。另外，带有pMV空载体的转基因烟草植株作为对照使用。我们观察发现，EsMYBFl基 因的超量表达使得转基因烟草花色变淡，由明显红色转变为淡红色或者粉色（图5)。
[0045] 2.转基因烟草花组织中总花青素和黄酮醇含量测定
[0046] 为了探明转基因烟草花色变淡背后的原因，我们对转基因烟草花组织中的总花青 素和黄酮醇的含量进行了测定。我们采用分光光度法测量总花青素含量，使用HPLC(High Per formance Liquid Chromatography，高效液相色谱)方法分析黄酮醇含量。待测定的实 验材料包括3个EsMYBFl超量表达的转基因烟草株系的花组织样本$33^38^40)，和1个携 带有空载体PMV的转基因烟草花组织对照样本(CK)。待转基因烟草处于盛花期时，采集整个 花朵，经液氮速冻后放置于-70°C保存备用。转基因烟草花组织中类黄酮成分的提取、分离 和测定按照已发表文献的说明进行操作(Huang W，Zeng S,Xiao G,Wei G,Liao S,Chen J, Sun ff,Lv H,ffang Y.Elucidating the biosynthetic and regulatory mechanisms of flav onoid-derived bioactive components in Epimedium sagittatum.Frontiers in Plant Science，2015，6:689)。关于总花青素的含量测定来说，取一定量的冷冻样本在液氨 中充分研磨，称取50-100mg的样本粉末，置于lmL的1%盐酸/甲醇（l%HCl/Methanol)抽提 液中，于4 °C黑暗条件下浸泡2 4 h，期间每隔几小时摇晃下样本。在12，0 0 0 g转数下离心 l〇min，然后收集上清液，并过0.22μπι滤膜即为抽提液，放于-70°C保存待测。使用Tecan公司 的Infinit e 200 PRO型号的多功能酶标仪检测待测抽提液在530nm和657nm波长下的吸光 值，利用公式A530-0.25*A657计算出总花青素对应的吸光值，然后用这个吸光值除以样本 鲜重即为总花青素的相对含量。在测量样本吸光值时，使用l%HCl/Methanol抽提液作为空 白对照。每个样本有5个不同的生物学重复，每个生物学重复测量三次。
[0047]关于转基因烟草花组织中的黄酮醇测定来说，称取100_200mg经液氮充分研磨的 样本粉末，置于3ml 80%甲醇溶液中超声处理30!^11，然后放在4°(：冰箱过夜。在12,00(^转 数下离心10min，取上清液待下一步处理。通过酸水解抽提物释放黄酮醇苷的糖基，最终以 黄酮醇糖苷配基(flavonol aglycones)的含量作为烟草样本中的黄酮醇含量。取上述上清 液400yL转移到离心管中，加120yL的HC1(浓度为3M)，90°C加热lh，然后再加200yL甲醇混 匀。此水解液再通过〇.22μπι滤膜，滤液置于-70°C保存待测。HPLC分析所用仪器为Agilent 1100型号，色谱柱为Agilent 1^-(：18(5以111，4.6*25〇111111)。采取三元流动相进行冊^：分离，流 动相Α(0· 1 % 甲酸水，0 · 1 %formic acid/water)，流动相B(乙臆，acetonitrile)和流动相C (甲醇，methanol)。梯度分离程序为：Omin，10%B+2%C; lOmin，20%B+4%C; 15min，50%B+ 10%(：;2011^11，20%8+4%(：;2511^11，10%8+2%(： ;2811^11，10%8+2%(：。柱温为25。(：，流速为 1.0mL/min，进样量为10yL，检测波长为350nm。转基因烟草样本中黄酮醇化合物的鉴定根据 商品化的标准品山奈KKKaempferol)和槲皮素(Quercetin)进行比较，其含量的测定依据 样本中黄酮醇色谱峰的峰面积和标准品的标准曲线进行换算。每个样本有5个独立的生物 学重复，并且每个重复测量3次。类黄酮成分测定的结果表明，EsMYBFl基因的超量表达使得 转基因烟草花组织中总花青素含量下降，而黄酮醇（山奈酚和槲皮素)含量上升（图6)。与对 照相比，总花青素含量下降了近33%-46%，山奈酚则从108yg/g上升到最高的247yg/g，增 加约2倍多，槲皮素则从175yg/g上升到最高的367yg/g，增加约2倍。
[0048] 3.转基因烟草花组织中类黄酮合成相关结构基因的表达分析
[0049]为了分析外源EsMYBFl基因的超量表达是否对转基因烟草花组织中类黄酮合成途 径相关结构基因的表达有所影响，我们利用实时定量PCR分析确定类黄酮途径相关基因的 表达水平。待分析的材料包括3个EsMYBFl超量表达的转基因烟草株系的花组织样本(F33， F38，F40)，和1个携带有空载体pMV的转基因烟草花组织对照样本(CK)(图7)。待转基因烟草 处于盛花期时，采集整个花朵，经液氮速冻后，置于_70°C保存备用。总RN A提取，检测，反转 录及定量PCR等操作均按照实施例2中的"EsMYBFl基因的组织表达模式分析"说明进行操 作。简单来说，利用RNAiso Plus试剂（Takara公司）抽提烟草花组织总RNA，经电泳和 NanoDrop 2000检测总RNA的质量和浓度，然后利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara公司）试剂盒进行反转录，最后利用SYBR Premix E x Taq II (T1 i RNaseH Plus)(Takara公司)试剂盒进行定量PCR反应。用于实时定量PCR分析的烟草类黄酮 合成途径相关结构基因包括NtCHS(chalcone synthase，查尔酮合成酶），NtCHI(chalcone isomerase，查尔酮异构酶），NtF3 ' H(flavonoid 3 ' -hydroxylase，类黄酮3 轻化酶）， 财卩3!1(；1^1&￥&110116 3-117(11'(?71&86，黄烧酮3-轻化酶），财？1^(；1^1&￥011〇187111：11&8 6，黄酮醇 合成酶），NtDFR(dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇还原酶）和 NtANS (anthocyanidin synthase，花青素合成酶)等，并且使用烟草NtTubl基因作为内参基因。这 些基因的实时定量PCR分析所用引物序列如表1所示。同样，也是使用Comparative Ct方法 (Schmittgen TD,Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method·Nature Protoco 1 s，2008,3(6):1101-1108)进行基因的相对表达量计算，设定对照 样本的基因表达量为"Γ。实时定量PCR分析结果表明，EsMYBFl基因的超量表达使得转基因 烟草花组织中黄酮醇合成途径的结构基因（NtCHS，NtCHI，NtF3H，NtFLS)上调表达，而花青 素合成相关的下游结构基因（NtDFR和NtANS)下调表达(图7)。
[0050]表1用于转基因烟草中实时定量PCR分析的引物序列
【主权项】
1. 一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。2. 编码权利要求1所述蛋白质的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其序列为SEQ ID NO.1所示。4. 权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在调控烟草黄酮醇合成上的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种调控植物黄酮醇合成的基因及应用。通过RACE技术从箭叶淫羊藿中获得了一条全长cDNA序列，并命名为<i>EsMYBF1</i>基因，其序列为SEQ？ID？NO.1所示。<i>EsMYBF1</i>基因编码的蛋白序列为SEQ？ID？NO.2所示。通过基因工程技术提高<i>EsMYBF1</i>基因的表达量能够诱导黄酮醇合成基因的表达，从而促进黄酮醇的合成与积累。
【IPC分类】C07K14/415, C12N15/29, A01H5/00
【公开号】CN105646686
【申请号】
【发明人】黄文俊, 王瑛
【申请人】中国科学院武汉植物园
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月21日