一种调控植物黄酮醇合成的基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程和生物技术领域。具体涉及到一种调控淫羊藿黄酮醇合 成途径的EsMYBFl基因的分离克隆，功能分析和应用。EsMYBFl具有调控黄酮醇合成途径相 关基因表达的功能，从而改变黄酮醇合成代谢。本发明还涉及到EsMYBFl基因在改变植物黄 酮醇合成代谢上的应用。
【背景技术】
[0002] 淫羊藿(Herba epimedii)是使用最为悠久的中草药之一，最早记载于《神农本草 经》;也是现在应用最为广泛的中草药之一(郭宝林，肖培根。中药淫羊藿主要种类评述。中 国中药杂志，2003,8(4) :303-307)。淫羊藿药材主要来源于小檗科(Berberidaceae)淫羊藿 属(Epimedium)中的少数几个物种的干燥叶片。淫羊藿属物种有50余种，绝大部分广泛分布 于我国；其中被《中国药典》2010版收录的仅有5种，包含有淫羊藿(E.brevicornu Maxi m)、 朝鲜淫羊藿（E · koreanum Nakai)、箭叶淫羊藿（E · sagittatum(Sieb · et Zucc · )Maxim)、柔 毛淫羊藿(E · pubescens Maxim)、巫山淫羊藿(E · wushanense T · S · Ying)。淫羊藿不仅具有 补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效，而且还有抗衰老、抗肿瘤、改善免疫功能等功效(Ma H，He X,Yang Y,Li M,Hao D,Jia Z.The genus Epimedium:An ethnopharmacological and phytoch emical review.J Ethnopharmacol,2011，134(3):519-541)，因而也是最具开发 潜力的中药材之一，受到国内学者的高度重视。除此之外，淫羊藿植株的的花和叶形态各 异，颜色丰富多彩，具有较高的园林观赏价值(任璘，戴思兰，王瑛。淫羊藿属植物种质资源 及其园林应用。武汉植物学研究，2008，26 (6): 644-649)。
[0003] 大量研究表明淫羊藿中主要活性成分为类黄酮化合物，特别是C8位置异戊烯修饰 的黄酮醇苷类化合物（Ma H，He X，Yang Y，Li M，Hao D，Jia Z.The genus Epimedium:An ethno pharmacological and phytochemical review.J Ethnopharmaco1,2011,134(3): 519-541)。例如，常用于淫羊藿药材质量控制和化学型分类的四种主要活性成分，朝藿定A， B，C和淫羊藿苷(Epimedin A，B，C, Icariin)，均属于黄酮醇苷类化合物。众所周知，黄酮醇 苷代谢物属于类黄酮合成途径中的黄酮醇分支途径的末端产物。类黄酮合成途径早已成为 植物次生代谢途径中研究最多最清楚的途径之一，参与此途径中的所有结构基因在多个模 式植物中得到了分离和功能鉴定，如拟南芥、玉米、矮牵牛、葡萄等（Winkel-Shirley B.Flavonoid biosynt hesis. a colorful model for genetics , biochemistry,cell biology，and biotechnology.Plant Physiol ,2001，126(2) :485-493)。最近，在箭叶淫羊 藿中类黄酮合成途径也得到了解析，绝大部分相关结构基因得到分离和鉴定(Huang W， Zeng S, Xiao G,ffei G, Liao S, Chen J, Sun ff,Lv H, Wang Y. Elucidating the biosynthetic and regulatory mechanisms of flavonoid-derived bioactive c omponents in Epimedium sagittatum.Frontiers in Plant Science，2015，6:689) 〇众多 研究表明，淫羊藿中主要活性成分的合成与积累受到环境因子和发育因子的影响，如光、蔗 糖、植物激素、发育阶段等（Zeng S, Liu Y, Wang Y.Light stress suppresses the accumulation of epimedi ns A，B，C，and icariin in Epimedium,a traditional medicinal plant.Acta Physiol Plant,2013,35(11):3271-3275；Zeng S,Liu Y,Hu ff, Liu Y,Shen X,ffang Y.Integrated transcriptional and phyt ochemical analyses of the flavonoid biosynthesis pathway in Epimedium.Plant Cell Tiss Organ C ult， 2013,115(3) :355-365)，这意味着黄酮醇主要活性成分的合成积累可能受到某些转录因子 的调控，如MYB，bHLH转录因子等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种调控植物黄酮醇合成的蛋白，其序列为SEQ ID N0.2 所示。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种调控植物黄酮醇合成的基因 EsMYBFl，该基因 编码SEQ ID N0.2所示蛋白质，优选序列为SEQ ID NO. 1所示。该基因可以调控黄酮醇合成 途径相关基因的表达，从而改变黄酮醇代谢物的合成，为以后的淫羊藿活性成分黄酮醇的 代谢工程研究奠定基础。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种调控植物黄酮醇合成的基因 EsMYBFl在调控烟 草黄酮醇合成上的应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
[0008] 一种调控植物黄酮醇合成的蛋白，其序列为SEQ ID N0.2所示。
[0009] 编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
[0010] 编码SEQIDN0.2所示蛋白的基因序列优选为SEQIDN0.1所示。
[0011] 扩增SEQ ID NO. 1 所示序列的引物为：5'-CGCCCTTCAAGCTTTTCTGGT-3'和5'-TTACAACATTCTTCTTATGTAACATTCG-3 '。
[0012] 一种调控植物黄酮醇合成途径的基因 EsMYBFl在调控烟草黄酮醇合成上的应用， 将EsMYBFl基因的编码区利用常规分子生物学手段在烟草中超量表达，结果发现烟草花中 花青素含量下降而黄酮醇含量上升，并且类黄酮途径相关基因的表达受到影响，其中黄酮 醇合成相关基因上调表达，而花青素合成相关基因则下调表达。
[0013] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0014] 1.本发明克隆的EsMYBFl基因具有调控黄酮醇合成途径的功能，这对阐明淫羊藿 中黄酮醇主要活性成分合成积累的调控机制有着重要意义。
[0015] 2.本发明克隆的EsMYBFl基因通过转基因技术可以改变转基因植株中类黄酮相关 结构基因的表达，从而影响类黄酮代谢物的生物合成，特别是黄酮醇的生物合成。
【附图说明】
[0016] 图1.为一种EsMYBFl在箭叶淫羊藿不同组织中的基因表达模式示意图。
[0017] 结果表明：EsMYBFl基因主要在叶片组织中表达。
[0018]图2.为一种用于瞬间双焚光素酶分析实验的表达载体pGreen II 62-SK和pGreen II 0800-LU C的T-DNA区域的示意图。
[0019] 载体pGreen II 62-SK作为双荧光素酶分析中激活因子(effector)，用于转录因 子的表达，而pGreen II 0800-LUC作为双焚光素酶分析中的报告因子(reporter)，用于结 构基因启动子的构建。
[0020] 图3.为一种EsMYBFl或者和EsTT8，AtTT8 bHLH调控蛋白对类黄酮途径相关结构基 因的启动子的激活实验示意图。
[0021]用于瞬间双焚光素酶分析实验的启动子有:EsCHS(chalcone synthase，查尔酮合 成酶），EsF3H(f lavanone 3-hydroxylase，黄烧酮3_轻化酶），EsFLS(flavonol synthase， 黄酮醇合成酶），EsDFRl (dihydrof lavonol 4-reductase，二氢黄酮醇还原酶），EsDFR2和E sANS(anthocyanidin synthase，花青素合成酶）等；转录因子则有EsMYBFl，EsTT8,At TT8， AtMYB12等。EsMYBFl具有特异激活EsF3H和EsFLS结构基因启动子的能力，但是不具有与 bHLH调控蛋白互作激活靶基因启动子的能力。
[0022] 图4.为一种用于EsMYBF 1超量表达载体构建的pMV载体的T-DNA区域示意图。
[0023] LB和RB分别表示T-DNA区域的左边界和右边界;NPT II为植物抗性标记基因，赋予 植物抗卡拉霉素的能力;P