35s-EsMYBF1-TNcis表达框表示EsMYBFl基因处于CaMV 35S启动子和 No s终止子的控制下表达。
[0024] 图5.为一种超量表达EsMYBFl的转基因烟草表型观察示意图。
[0025]对照为转空载体(empty vector)的转基因烟草株系，而EsMYBFl超量表达的转基 因烟草株系有F33，F38和F40。EsMYBFl的超量表达使得烟草花色变淡。
[0026]图6.为一种超量表达EsMYBFl对转基因烟草中花青素(A)和黄酮醇(B)合成积累的 影响示意图。
[0027]相对于转空载体的转基因烟草对照（CK)而言，EsMYBFl的超量表达使得转基因烟 草花(F33，F38，F40)中的花青素含量降低，而黄酮醇含量上升。
[0028]图7.为一种超量表达EsMYBFl对转基因烟草中类黄酮相关基因表达的影响示意 图。
[0029] CK代表转空载体的对照植株，而F33，F38和F40代表含有EsMYBFl超量表达的转基 因烟草株系。相对于转空载体的转基因烟草对照而言，EsMYBFl的超量表达改变了烟草花中 类黄酮相关结构基因的表达，其中黄酮醇合成相关基因上调表达，而花青素合成相关基因 则下调表达。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1: EsMYBFl基因的分离克隆
[0031] 以箭叶淫羊藿叶片组织的全长c D N A为模版，引物序列为5 ' -CGCCCTTCAAGCTTTTCTGGT-3 ' 和5 ' -TTACAACATTCTTCTTATGTAACATTCG-3 '，使用高保真性DNA 聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司）去扩增目的基因的全长cDNA克隆。按 照其说明书进行PCR反应体系配置和运行。具体反应体系为50yL，其中箭叶淫羊藿叶片cD ΝΑ模版2yL，5XPrimeSTAR buffer 10yL，2.5mM dNTP 4yL，正反向引物各lyL，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5yL，加 ddH20至50yL。反应程序为98°C预变性，lmin;98°C 15sec、56 。(：15sec、72°C lmin，32cycles;72°C延伸SmiruPCR扩增出一条大小约为 1.2-1.3kb的明亮 主带，将PCR产物回收，通过加 A反应后连接至pMD19-T载体上，并克隆测序。其中加 A反应体 系为 10yL，回收的PCR产物7yL，10XTaq buffer luL，2mM dATP lyL，5U/yL Taq DNA polymerase lyL，72°C保温 15_30min即可完成加 A反应。
[0032] 测序结果表明：获得了一种分离的基因，并命名为EsMYBFl基因，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0033] 实施例2: EsMYBFl基因的组织表达模式分析
[0034] 为了分析EsMYBFl基因的组织表达模式，我们利用实时定量PCR检测EsMYBFl基因 在箭叶淫羊藿不同组织中的表达水平。首先，在箭叶淫羊藿盛花期收集幼嫩的叶片、花蕾、 花、根和果实等组织，经过液氮速冻，置于_70°C保存。然后，利用RNAiso Plus试剂(Ta kara 公司）抽提上述叶片、花和花蕾组织的总RNA，而用它再结合Fruit-mate for RNA Puri f icat ion试剂(Takara公司）抽提上述根和果实组织的总RNA，再利用凝胶电泳和核酸微量 检测仪NanoDrop 2000确定总RNA的质量和浓度。取lyg总RNA进行反转录，反转录试剂盒为 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara公司），反转录之前使用其中的 gDNA Eraser消化总RNA溶液中可能存在的基因组DNA污染。消化反应体系为10μ L，包括5 X gDNA Eraser buffer 2yL，gDNA Eraser lyL，总RNA lyg，加 RNase free ddH2〇至 10此。42 °C保温2min，然后降至于4°C保温。将此反应产物10此全部用来反转录，反转录体系为5X Primescript buffer 4yL,RT primer mix lyL,Primescript RT enzyme m ix lyL，RNase free ddH20 4μΙ^37Γ反转录15min，然后85°C，5sec失活，再恒温于4°C保存。最后，将反转 录的cDNA产物稀释5-10倍作为实时定量PCR中的模板，置于-20°C保存备用。参考定量PCR试 剂盒SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(Takara公司）的操作说明书进行引物设 计，EsMYBFl 的定量PCR 弓| 物为5 ' - AATAGGTGGTCACTGATTGCTGC-3 ' 和5'_ CACCCATCTTGGCTAAGTTCATC-3 '，内参 EsActin 基因的定量 PCR 引物为5'-GCCATTCAGGCTGTTCTTTC-3 ' 和5 ' -GGTAAGATCGCGACCTGCTA-3 '。实时定量PCR反应体系和运行 程序参考说明书进行。具体来说，实时定量PCR反应体系为2XSYBR Premix Ex Taq II 10μ L，10yM引物各0.8yL，50XR0X Reference Dye II 0.4yL，cDNA模板2yL，加 RNase free ddH20至20yL。定量PCR反应在ABI公司PRISM 7500Fast型定量PCR仪上完成。反应程序采用 两步法:95°C预变性30sec;95°C变性3sec，60°C退火延伸30sec，循环数40;反应结束后运行 溶解曲线程序，以确保目的产物的特异扩增。最后，我们使用Comparative Ct方法进行基因 的相对表达量计算（Schmittgen TD,Li vak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.Nature Protocols,2008,3(6): 1101-1108)。定量PCR分析结果表 明EsMYBFl基因主要在叶片组织中表达，而在其它组织中表达量极低（图1)。
[0035]实施例3:瞬间双荧光素酶分析
[0036]为了分析EsMYBFl基因对类黄酮合成途径中的结构基因启动子是否具有转录激活 能力，我们采用在本式烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中进行瞬间双焚光素酶分析 (trans ient dual-luciferase assay)。本实验中使用的载体和方法均参考文献(Hellens RP,Allan AC,Friel EN,Bolitho K,Grafton K,Templeton MD,Karunairetnam S,Gleave AP,Laing WA. Transi ent expression vectors f or functional genomics , quantification of promoter activity and RNA silen cing in plants. Plant Methods,2005,1(1) :1)。报告载体（reporter vector)为pGreen II 0800-LUC，含无启动子 的LUC报告基因，同时带有CaMV 35S启动子驱动的Ren报告基因作为内参。将目的基因的启 动子片段克隆此报告载体，用于激活下游LUC的表达（图2)。激活载体(effector vector)为 pGreen II 62-SK，内含CaMV 35S-MCS-Ter CaMV表达框，将转录因子克隆至此载体，用于超 量表达转录因子（图2)。用于瞬间双荧光素酶分析的类黄酮合成途径中相关结构基因的启 动子包括有：ProEsCHS(chalcone synthase，查尔酮合成酶），ProEsF3H(flavanone 3-hydroxylase，黄烧酮3-轻化酶），ProEsFLS(flavonol synt hase，黄酮醇合成酶）， ProEsDFRl(dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇还原酶），P roEsDFR2和ProEsANS (anthocyanidin synthase，花青素合成酶）；转录因子则有 EsMYB FI，EsTT8，AtTT8， AtMYB12等。其中，分别包含有ProEsDFRl和ProEsANS启动子序列的pGreen II 0800-LUC重 组质粒，以及分别包含有EsTT8和AtTT8转录因子的pGreen II62-SK重组质粒已由本实验室 早期构建完成，可以直接使用，具体构建过程参见文献(Hu ang W，Sun W，Lv H，Luo M，Zeng S,Pattanaik S,Yuan L,ffang Y.A R2R3-MYB transcription factor from Epimedium sagittatum regulates the flavonoid biosynthetic pathway.PLoS ONE,