CAGCAC-3 ' ； SRRP1-RT-R: 5 ' -GCCCATGCCCAGCGTGTT-3 '。以拟南芥AtUBQ3基因作为内参，引 *SAtUBQ3-F: 5 ' -CGGAAAGACCATTACTCTGGA-3 ' ； AtUBQ3-R: 5 ' -CAAGTGTGCGACCATCCTCAA-3 '。结果显示， 35S: SRRP1-1、35S: SRRP1-2 和 35S: SRRP1-3 中的 SRRP1 基因均有表达。
[0121] 按照上述农杆菌介导法转化拟南芥方法，将GV3101-SRRPl:pGFPGUS替换为 GV3101-pGFPGUS，其他步骤均不变，得到转空载体pGFPGUS拟南芥，将其命名为At-pGFPGUS。
[0122] 2.2转51?^2基因拟南芥的获得
[0123] 按照步骤2.1农杆菌介导法转化拟南芥方法，将GV3101-SRRPl:pGFPGUS替换为 GV3101-SRRP2: pCAMBIA3301，其他步骤均不变，得到转SRRP2基因拟南芥。
[0124] 将得到的转SRRP2基因拟南芥命名为35S:SRRP2。将T1代35S:SRRP2种子在MS培养 基上经20mg · I/1的PPT除草剂和50mg · I/1的潮霉素抗性筛选，选择T3代不再发生潮霉素抗 性性状分离的株系，共三个株系，分别命名为35S: SRRP2-1、35S: SRRP2-2和35S: SRRP2-3。
[0125] 利用 RT-PCR 检测 355:51?1^2-1、355:51?^2-2和355:51?^2-3中目的基因的表达情 况，用野生型拟南芥作为对照。所用引物为：SRRP2-RT-F: 5 ' -ACGCCGCACAGTACACCAA-3 ' ； SRRP2-RT-R: 5 ' -CCAAACGAGTAAAGGAAGCAAAT-3 '。以拟南芥AtUBQ3基因作为内参，引物为步 骤2 · 1 中的AtUBQ3-F和AtUBQ3-R。结果显示，35S: SRRP2-1、35S: SRRP2-2和35S: SRRP2-3中的 SRRP2基因均有表达。
[0126]按照上述农杆菌介导法转化拟南芥方法，将GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301替换为 GV3101-pCAMBIA3301，其他步骤均不变，得到转空载体pCAMBIA3301拟南芥，将其命名为At-PCAMBIA3301。
[0127] 2.3转SRRP1基因和SRRP2基因拟南芥的获得
[0128] 利用步骤 1 的 GV3101-SRRPl:pGFP⑶ S 和 GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301 采用农杆菌介 导法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，具体方法如下：
[0129] 将 GV3101-SRRP1 :pGFPGUS 和 GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301 分别活化。吸取 lml GV3101-SRRPl:pGFPGUS 菌液加入 40ml 含有 Kan(50mg/1)和 Rif(50mg/1)的 LB 培养基中，28 °C，230rpm摇床上培养至0D6QQ达0.8左右，将菌液转移至50ml离心管内，3000rpm，离心5min， 去上清液，得到GV3101-SRRPl:pGFP⑶S菌体；吸取lml GV3101-SRRP2:pCAMBIA3301 菌液加 入40ml含有Kan(50mg/l)和Rif (50mg/l)的LB培养基中，28°C，230rpm摇床上培养至OD6q〇达 0.8左右，得到GV3101-SRRP2: pCAMBIA3301菌体。配制侵染液（1/2MS培养基含5 %蔗糖，500μ 1/1 调为5.8)。将GV3HU-SRRP1 :pGFPGUS菌体和GV31(U-SRRP2: PCAMBIA3301菌体混合后用30ml侵染液，缓慢重悬，得到农杆菌侵染液。将初花的拟南芥花 序浸泡在农杆菌侵染液内lmin左右。暗条件下处理约12h后，置于拟南芥适宜环境内，一周 后，重复侵染一次。
[0130] 将得到的转SRRP1基因和SRRP2基因的拟南芥命名为35S:SRRP1+35S:SRRP2<^_T1 代353:31?1^1+353 :31?^2种子在13培养基上经2〇11^.厂1的？？1'除草剂和5〇11^.厂1的潮霉素 抗性筛选，选择T3代不再发生潮霉素抗性性状分离的株系，共三个株系，分别命名为35S: SRRP1+35S: SRRP2-1、35S: SRRP1+35S: SRRP2-2 和 35S: SRRP1+35S: SRRP2-3。
[0131 ]利用RT-PCR检测35S: SRRP1+35S: SRRP2-1、35S: SRRP1+35S: SRRP2-2和35S: SRRP1+ 35S:SRRP2-3中目的基因的表达情况，用野生型拟南芥作为对照。所用引物为：步骤2.1的 SRRP1-RT-F与 SRRP1-RT-R，步骤2.2 的 SRRP2-RT-F与 SRRP2-RT-R。以拟南芥AtUBQ3基因作为 内参，引物为步骤2 · 1 中的AtUBQ3-F 和AtUBQ3-R。结果显示，35S: SRRP1+35S: SRRP2-1、35S: SRRP1+35S: SRRP2-2 和 35S: SRRP1+35S: SRRP2-3 中的 SRRP1 基因和 SRRP2 基因均有表达。
[0132] 按照上述方法，将 GV3101 -SRRP 1: pGFPGUS替换为 GV3101 -pGFPGUS，并将GV3101 -SRRP2:pCAMBIA3301替换为GV3101-pCAMBIA3301，其他步骤均不变，得到转空载体pGFP⑶S 和 PCAMBIA3301 拟南芥，将其命名为 At-pGFPGUS+pCAMBIA3301。
[0133] 二、转基因拟南芥耐盐性的检测
[0134] 通过检测步骤一的转SRRP1基因拟南芥、转SRRP2基因拟南芥和转SRRP1基因和 SRRP2基因拟南芥在盐胁迫下的萌发率、根长、叶绿素含量，检测转基因拟南芥的耐盐性，实 验重复二次。
[0135] 1、萌发率实验
[0136] 分别在NaCl-MS培养基(NaCl-MS培养基为向MS培养基中添加 NaCl得到的NaCl浓度 为150mM的固体培养基）中点种消毒后的野生型拟南芥(WT)和步骤一的各转基因拟南芥 (35S:SRRPl-l、35S:SRRPl-2、35S:SRRPl-3、At-pGFP(iUS、35S:SRRP2-l、35S:SRRP2-2、35S: SRRP2-3、At-pCAMBIA3301、35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2、35S:SRRP1+ 35S: SRRP2-3和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301)种子，每个株系拟南芥50粒种子，3个重复，并将 在MS固体培养基中生长的各株系作为相应拟南芥的对照。
[0137] 播种后，4°C放置3d后置于温室（22°C)正常培养，培养条件为相对湿度80%，温度 20~24°C，光照强度80~200ym〇l/(m2 · s)，光周期为16h光照和8h黑暗。当种子幼根已经穿 出种皮记为萌发，每天统计种子的萌发率(在发芽试验初期，在规定的日期内正常发芽的种 子数占供试种子数的百分率也叫种子发芽势。在盐胁迫下，拟南芥的发芽势为拟南芥种子 在发芽第三天的萌发率）。结果发现，野生型拟南芥(WT)、At-pGFPGUS、At-pCAMBIA3301和 At-pGFPGUS+pCAMBIA3301的萌发率基本无差异。将在MS固体培养基中生长的相应的拟南芥 作为对照，计算各拟南芥的相对萌发率，各拟南芥的平均相对萌发率如表2所示，转基因拟 南芥与野生型拟南芥平均相对萌发率间的倍数关系如表3所示，35S: SRRP1+35S: SRRP2平均 相对萌发率与35S:SRRP1和35S:SRRP2的倍数关系如表4所示。使用SPSS统计软件17.0(SPSS Inc.，USA)对数据进行学生t测验分析。
[0138]
[0139] 表2、转基因拟南芥的平均相对萌发率（％ )
[0140]
[0141] 表3、转基因拟南芥平均相对萌发率与野生型拟南芥的倍数关系
[0142]
[0143] 表4、35S: SRRP1+35S: SRRP2平均相对萌发率与35S: SRRP1和35S: SRRP2的倍数关系
[0144]
[0145] 结果显示，在播种第3天，35S: SRRP1、35S: SRRP2和 35S: SRRP1+35S: SRRP2 的平均相 对萌发率（即平均相对发芽势)分别为WT的7.43、7.74和10.03倍，随着播种时间的延长，该 这些倍数关系逐渐降低;353:31?^1+353 :31?^2的平均相对萌发率分别为353:31?1^1和353: SRRP2的1.35和1.30倍，随着播种时间的延长，该这些倍数关系也逐渐降低。表明，35S: SRRP1和35S:SRRP2可以提高拟南芥在NaCl模拟的盐胁迫环境中的发芽势，35S:SRRP1和 35S:SRRP2的联用可以进一步提高拟南芥在NaCl模拟的盐胁迫环境中的发芽势。
[0146] 2、根长实验
[0147] 分别在MS培养基中点种消毒后的野生型拟南芥(WT)和步骤一的各转基因拟南芥 (35S:SRRPl-l、35S:SRRPl-2、35S:SRRPl-3、At-pGFP(iUS、35S:SRRP2-l、35S:SRRP2-2、35S: SRRP2-3、At-pCAMBIA3301、35S:SRRP1+35S:SRRP2-1、35S:SRRP1+35S:SRRP2-2、35S:SRRP1+ 35S:SRRP2-3和At-pGFPGUS+pCAMBIA3301)种子，每个株系拟南芥50粒种子。
[0148] 播种5天后，各拟南芥各取6株转移至100mM NaCl-MS培养基（100mM NaCl-MS培养 基为向MS培养基中添加 NaCl得到的NaCl浓度为100mM的固体培养基）中，在正常条件下竖直 培养7天，培养条件为相对湿度80%，温度20~24°C，光照强度80~200ym 〇l/(m2 · s)，光周 期为16h光照和8h黑暗，测量幼苗的根长，共6个重复。
[0149] 将在MS固体培养基中播种5天后又在正常条件下竖直培养7天的各拟南芥作为相 应拟南芥的对照。依据下