成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用_2

文档序号:9881097阅读:来源:国知局
或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全 文引用。合适的转录终止子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子)、花椰 菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶 终止子(参见,例如:〇dell等人(I985)Nature 313:810;1?〇86油6邙等人(1987)66116,56:125; Guerineau等人(1991)Mol .Gen.Genet,262:141 ;Proudfoot(1991)Cell ,64:671 ;Sanfacon 等人Genes Dev.,5:141 ;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261 ;Munroe等人(1990)Gene, 91:151;Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.l7:7891;Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res .,15:9627)〇
[0058]可用现有的表达载体构建含有所述SRRP1基因表达盒的重组载体或含有所述 SRRP2基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹 轰击的载体等。如?4狀25邛8丨11438邛041?141302邛041?142301 邛041?141301、 口〇八1?1八130〇4811214〇厶1?1厶1391-乂&或口0厶冊1厶1391113(0厶冊1厶公司)等。所述植物表达 载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域,即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工 或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端,如农杆 菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因 Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因) 3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时,还可使用 增强子,包括翻译增强子或转录增强子,这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域 起始密码子等,但必需与编码序列的阅读框相同,以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控 制信号和起始密码子的来源是广泛的,可以是天然的,也可以是合成的。翻译起始区域可以 来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对 所用植物表达载体进行加工,如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化 合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗 生素抗性的nptll基因,赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因,赋予对抗生素潮霉素抗性 的hph基因,和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因,赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化 学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。 从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以逆境筛选转化植株。
[0059] 上述应用中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
[0060] B13)所述重组载体可含有序列2所示的用于编码SRRP1的DNA序列;进一步B13)所 述重组载体具体可为将表达载体PGFPGUS的Bgl Π 和Pml I识别序列间的DNA片段替换为序列 2所示的SRRP1基因,保持载体的其他序列不变,得到重组载体,将该重组载体命名为SRRP1: pGFPGUS。与表达载体pGFP⑶S相比,SRRP1: pGFPGUS为将表达载体pGFPGUS的⑶S基因及其两 端的DNA片段替换为SRRP1基因得到的重组载体,SRRP1: pGFPGUS中SRRP1基因的表达由35S 启动,表达序列1所不的蛋白质。
[0061 ] B23)所述重组载体可含有序列4所示的用于编码SRRP2的DNA序列;进一步B23)所 述重组载体具体可为将表达载体PCAMBIA3301的Ncol和Bgin识别序列间的DNA片段替换为 序列4所示的SRRP2基因,保持载体的其他序列不变,得到重组载体,将该重组载体命名为 SRRP2: pCAMBIA3301。SRRP2: pCAMBI A3301中SRRP2基因的表达由35S启动,表达序列3所示的 蛋白质。
[0062] 上述应用中,所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中,细菌可来自埃希氏菌属 (Escherichia),欧文氏菌(Erwinia ),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属 (Flavobacterium),产喊菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属 (Bacillus)等。所述细菌具体可为农杆菌(如农杆菌GV3101)或大肠杆菌。
[0063] 上述应用中,所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0064]为解决上述技术问题,本发明还提供了下述H1-H4在所述1)_3)中任一种中的应 用:
[0065] HUSRRP2;
[0066] H2、SRRP1;
[0067] H3、所述与SRRP2相关的生物材料;
[0068] H4、所述与SRRP1相关的生物材料。
[0069] 为解决上述技术问题,本发明还提供了植物耐盐产品,所述植物耐盐产品含有下 述任一种:
[0070] P1、所述成套耐盐蛋白质;
[0071] P2、SRRP2;
[0072] P3、SRRP1;
[0073] P4、所述成套生物材料;
[0074] P5、所述与SRRP2相关的生物材料;
[0075] P6、所述与SRRP 1相关的生物材料。
[0076]所述成套耐盐蛋白质、SRRP2或SRRP1,或所述成套生物材料、所述与SRRP2相关的 生物材料或所述与SRRP 1相关的生物材料。
[0077]上述产品中,所述植物抗病剂可以以所述成套耐盐蛋白质、SRRP2、SRRP1、所述成 套生物材料、所述与SRRP2相关的生物材料或所述与SRRP1相关的生物材料作为活性成分, 还可以将所述成套耐盐蛋白质、SRRP2、SRRP1、所述成套生物材料、所述与SRRP2相关的生物 材料或所述与SRRP1相关的生物材料与其它耐盐物质进行组合得到的组合物作为活性成 分。
[0078] 上述产品中,所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为十字 花科植物,如拟南芥。
[0079] 为解决上述技术问题,本发明还提供了一种培育具有耐盐性的转基因植物的方 法。所述培育具有耐盐性的转基因植物的方法包括向受体植物中导入SRRP2的编码基因和/ 或SRRP1的编码基因得到耐盐性高于所述受体植物的耐盐性的转基因植物。
[0080] 在本发明的实施例中,所述SRRP2的编码基因(即序列4所示的DNA分子)通过含有 SRRP2基因表达盒的SRRP2基因重组表达载体导入目的植物中。所述SRRP2基因表达盒中,启 动SRRP2基因转录的启动子为35S启动子。所述SRRP1的编码基因(即序列2所示的DNA分子) 通过含有SRRP1基因表达盒的SRRP1基因重组表达载体导入目的植物中。所述SRRP1基因表 达盒中,启动SRRP1基因转录的启动子为35S启动子
[0081 ] 上述方法中,其中所述SRRP1基因和所述SRRP2基因均可先进行如下修饰,再导入 受体种子植物中,以达到更好的表达效果:
[0082] 1)根据实际需要进行修饰和优化,以使基因高效表达;例如,可根据受体植物所偏 爱的密码子,在保持本发明所述SRRP1基因和所述SRRP2基因的氨基酸序列的同时改变其密 码子以符合植物偏爱性;优化过程中,最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量,以 最好地实现植物中导入基因的高水平表达,其中GC含量可为35%、多于45 %、多于50 %或多 于约60 % ;
[0083] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列,以使翻译有效起始;例如,利用在植物中已 知的有效的序列进行修饰;
[0084] 3)与各种植物表达的启动子连接,以利于其在植物中的表达;所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子;启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化,而且也取决于靶物种;例如组织或器官的特异性 表达启动子,根据需要受体在发育的什么时期而定;尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的,反之亦然,但是理想地,选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达,单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达;
[0085] 4)与适合的转录终止子连接,也可以提高本发明基因的表达效率;例如来源于 CaMV的tml,来源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明 基因进行连接;
[0086] 5)引入增强子序列,如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列 (例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
[0087] 所述SRRP1基因表达载体和所述SRRP2基因表达载体均可通过使用Ti质粒、Ri质 粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转 化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。
[0088] 所述方法还包括从导入序列1所示的SRRP1的编码基因和/或序列3所示的SRRP2的 编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株,得到所述转基因植物。
[0089]上述方法中,所述SRRP2的编码基因可为所述B21)所述核酸分子;所述SRRP1的编 码基因可为所述B11)所述核酸分子。
[0090] 上述方法中,所述受体植物可为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为 十字花科植物,如拟南芥。
[0091] 本发明中,所述转基因植物理解为不仅包含将所述SRRP1基因和/或所述SRRP2基 因转化目的植物得到的第一代转基因植物,也包括其子代。对于转基因植物,可以在该物种 中繁殖该基因,也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种,特别包括商 业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0092]本发明中,所述耐盐性具体可体现在对NaCl模拟的盐环境的耐受能力上,如在 NaCl模拟的盐环境中的种子萌发率、种子相对萌发率、种子发芽势、种子相对发芽势、耐盐 指数、根长和/或叶片叶绿素含量。所述种子相对萌发率可为种子在NaCl模拟的盐环境中的 萌发率与种子在非盐环境中萌发率的比值。所述种子相对发芽势可为种子在NaCl模拟的盐 环境中的
当前第2页1 2 3 4 5 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1