成套耐盐蛋白质及相关生物材料在调控植物耐盐性中的应用_3

文档序号:9881097阅读:来源:国知局
发芽势与种子在非盐环境中发芽势的比值。所述耐盐指数可为所述植物幼苗在 NaCl模拟的盐环境中的根长与在非盐环境中的根长的比值。
[0093] 实验证明,SRRP1和SRRP2可以提高植物对NaCl模拟的盐环境的耐盐性,并且SRRP1 和SRRP2在提高植物对NaCl模拟的盐环境的耐盐性中具有协同作用:
[0094] 1、35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的相对于非 盐环境的萌发率与发芽势,35S: SRRP1和35S: SRRP2的联用可以进一步提高植物在NaCl模拟 的盐胁迫环境中的相对于非盐环境的萌发率与发芽势:在播种第3天,转SRRP1基因的35S: SRRP1、转 SRRP2 的 35S: SRRP2 和转 SRRP1 与 SRRP2 的 35S: SRRP1+35S: SRRP2 的相对于非盐环境 的萌发率分别为野生型的7.43、7.74和10.03倍,随着播种时间的延长,该这些倍数关系逐 渐降低;35S: SRRP1+35S: SRRP2的相对于非盐环境的萌发率萌发率分别为35S: SRRP1和35S: SRRP2的1.35和1.30倍,随着播种时间的延长,该这些倍数关系也逐渐降低。
[0095] 2、35S: SRRP1和35S: SRRP2可以提高植物的耐盐指数,35S: SRRP1和35S: SRRP2的联 用可以进一步提高植物的耐盐指数:35S: SRRP1、35S: SRRP2和35S: SRRP1+35S: SRRP2的耐盐 指数分别为WT的1.25、1.27和1.58倍;35S: SRRP1+35S: SRRP2的耐盐指数分别为35S: SRRP1 和 35S: SRRP2的 1.27 和1.25 倍。
[0096] 3、35S:SRRP1和35S:SRRP2可以提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的叶绿素含 量,35S:SRRP1和35S:SRRP2的联用可以进一步提高植物在NaCl模拟的盐胁迫环境中的叶绿 素含量:在盐环境中,35S: SRRP1、35S: SRRP2和35S: SRRP1+35S: SRRP2均比野生型耐盐,野生 型植物失绿严重;在盐环境中,35S: SRRP1、35S: SRRP2和35S: SRRP1+35S: SRRP2的叶绿素平 均含量分别为WT的1.23、1.25和1.62倍,353:31?^1+353:31?1^2的叶绿素平均含量分别为 35S: SRRP1 和 35S: SRRP2的 1.31 和1.29 倍。
[0097] 实验证明,可利用SRRP1与其编码基因以及SRRP2与其编码基因提高植物的耐盐 性。
【附图说明】
[0098] 图1为35S:SRRP1的苗期耐盐性实验结果。其中,35S:TaSRRPl表示35S:SRRP1,35S: TaSRRP2表示35S:SRRP2;Col-0表示野生型拟南芥(WT),L1-1 表示35S:SRRP1-1,L1_2表示 35S:SRRP1-2,L1_3 表示 35S:SRRPl-3。
[0099] 图2为35S:SRRP2的苗期耐盐性实验结果。其中,35S:TaSRRPl表示35S:SRRP1,35S: TaSRRP2表示35S: SRRP2; Col-Ο表示野生型拟南芥(WT),L2-1 表示35S: SRRP2-1,L2-2表示 35S: SRRP2-2,L2-3 表示 35S: SRRP2-3。
[0100] 图3为355:51?^1+355:51?1^2的苗期耐盐性实验结果。其中,3551351?^1表示355: SRRP1,35S: TaSRRP2表示35S: SRRP2; Col-Ο表示野生型拟南芥(WT),L12-1 表示35S: SRRP1+ 35S: SRRP21,L12-2 表示 35S: SRRP1+35S: SRRP2-2,L12-3 表示 35S: SRRP1+35S: SRRP2-3。 [0101] 图4为不同转基因拟南芥的苗期耐盐性结果。其中,35S:TaSRRPl表示35S:SRRP1, 35S: TaSRRP2表示35S: SRRP2; Col-Ο表示野生型拟南芥(WT)。
【具体实施方式】
[0102] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[0103] 下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0104] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0105] 下述实施例中的表达载体pGFPGUS为文献(王敏娟,侯文胜,王庆钰,等.过表达 GmNHXl基因提高大豆根系的耐盐性.大豆科学,2011,30(06): 889-894)中的pGFP⑶SPlus, 公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作 为其它用途使用。
[0106] 下述实施例中的表达载体pCAMBIA3301(Zhiyong Ni,Zheng Hu,Qiyan Jiang,Hui Zhang.GmNFYA3, a target gene of miR169,is a positive regulator of planttolerance to drought stress .PMB,82,113-129,2013;Zhiyong Ni, Zheng Hu, Qiyan Jiang,Hui Zhang.Overexpression of gma-MIR394a confers tolerance todrought in transgenic Arab i dops i s thaliana,Biochemical and BiophysicalResearch Communications ,427,330-335,2012)公众可从申请人处获得该生 物材料,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
[0107] 下述实施例中的拟南芥(Arabidopsis thaliana)为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0型)。
[0108] 实施例1、耐盐相关蛋白1和耐盐相关蛋白2可以提尚拟南芥的耐盐性
[0109] 本实施例提供了两个来自济麦19(宋建民,刘建军,刘爱峰,李豪圣,吴祥云,赵振 东。济麦19面团流变学和淀粉特性与面条品质分析,麦类作物学报,2004,24(1 ):15-17)的 蛋白质,分别为耐盐相关蛋白1 (以下简称SRRP1)和耐盐相关蛋白2(以下简称SRRP2),SRRP1 的氨基酸序列如序列表中序列1所示,SRRP1由序列2所示的DNA分子(SRRP1基因)编码; SRRP2的氨基酸序列如序列表中序列3所示,SRRP1由序列4所示的DNA分子(SRRP2基因)编 码。
[0110] 一、转基因植物的获得
[0111] 1、重组载体与重组菌的获得
[0112] 将表达载体pGFPGUS的Bgin和Pmll识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的 S R R P1基因,保持载体的其他序列不变,得到重组载体,将该重组载体命名为S R R P1 : pGFPGUS。与表达载体pGFP⑶S相比,SRRP1: pGFPGUS为将表达载体pGFPGUS的⑶S基因及其两 端的DNA片段替换为SRRP1基因得到的重组载体,SRRP1: pGFPGUS中SRRP1基因的表达由35S 启动,表达序列1所示的蛋白质SRRP1。
[0113] 将表达载体pCAMBIA3301的Ncol和Bgl Π 识别序列间的DNA片段替换为序列4所示 的S R R P 2基因,保持载体的其他序列不变,得到重组载体,将该重组载体命名为S R R P 2 : ρ〇ΑΜΒΙΑ3301ΑΚΚΡ2:ρ0ΑΜΒΙΑ3301中SRRP2基因的表达由35S启动,表达序列3所示的蛋白质 SRRP2〇
[0114] 将 SRRP1: pGFPGUS、pGFPGUS、SRRP2: pCAMBIA3301 和 pCAMBIA3301 分别导入农杆菌 GV3101 中,分别得到含有SRRP 1: pGFP⑶ S、pGFPGUS、SRRP2: pCAMBI A3301 和 pCAMBI A3301 的重 组菌,将其分别命名为GV3101-SRRP1 :pGFPGUS、GV3101-pGFPGUS、GV3101-SRRP2: PCAMBIA3301和GV3101-p3301。
[0115] 2、转基因拟南芥的获得
[0116] 2.1转SRRP1基因拟南芥的获得
[0117] 利用步骤1的GV3101-SRRPl:pGFPGUS采用农杆菌介导的拟南芥蘸花侵染法 (Clough SJ,Bent AF.1998.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J,16:735-743)车专化拟南芥 (Arabidopsis thaliana),具体方法如下:
[0118] 将 GV3101-SRRPl:pGFPGUS 活化,然后吸取 lml 菌液加入 40ml 含有 Kan(50mg/1)和 Rif (50mg/l)的LB培养基中,28°C,230rpm摇床上培养至0D6Q()达0.8左右。将菌液转移至50ml 离心管内,3000rpm,离心5min,去上清液。配制侵染液(1/2MS培养基含5%蔗糖,500μ1/1 511?的1-77。?!1调为5.8)。向收集菌体的离心管中加入约3〇1111侵染液,缓慢混匀,重悬菌液。 将初花的拟南芥花序浸泡在侵染液内lmin左右。暗条件下处理约12h后,置于拟南芥适宜环 境内,一周后,重复侵染一次。
[0119] 将得到的转SRRP1基因拟南芥命名为35S:SRRP1。将T1代35S:SRRP1种子在MS培养 基上经20mg · I/1的PPT除草剂和50mg · I/1的潮霉素抗性筛选,选择T3代不再发生潮霉素抗 性性状分离的株系,共三个株系,分别命名为35S: SRRP1-1、35S: SRRP1-2和35S: SRRP1-3。
[0120] 利用RT-PCR检测35S: SRRP1-1、35S: SRRP1-2和35S: SRRP1-3中目的基因的表达情 况,用野生型拟南芥作为对照。所用引物为:SRRP1-RT-F: 5 ' -AGGACCAGACCGC
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