钆 的含量比，从而使得到的金钆复合纳米材料中的含钆层厚度不同。
[0150] 实施例4
[0151] 本实施例用于说明不同浓度的金钆复合纳米材料在激光照射下的升温情况。
[0152] 将实施例1中制备的金钆复合纳米材料溶液，离心水洗一次，用3倍体积的水分散， 材料浓度是250yg/mL，再分别稀释2倍(材料浓度是125yg/mL)、4倍（材料浓度是62.5yg/ 1^)、8倍(材料浓度是31.3以8/11^)、16倍(材料浓度是15.6以8/1^)，各取出40(^置于1.51^小 离心管中用808nm连续波激光照射(功率是1W，光斑直径5mm)，用热像仪记录升温过程中的 最高温度。图3是升温过程中溶液的最高温度对载体浓度作的曲线，可以看到不同浓度的载 体溶液9min时达到最高温度，然后温度保持平衡。
[0153] 实施例5
[0154]本实施例用于说明金钆复合纳米作为载体并载药的制备过程。
[0155]取ImL实施例1中制备的金IL复合纳米载体材料(0.75mg/mL)，离心，甲醇洗一次， 水洗一次，然后用ImL 0.2mg/mL盐酸阿霉素水溶液分散，室温下磁力搅拌1.5h。然后离心， 水洗一次，合并上清液，用酶标仪测量上清液在480nm处的吸光度值，代入标准曲线计算上 清液液中盐酸阿霉素的含量。载药率和包封率通过下面的公式计算:载药率（％) =药物组 合物中药物质量/(载体质量+药物组合物中药物质量)*1〇〇%;包封率（％)=载体中药物质 量/投入药物总量*100%。从表1可以看出，盐酸阿霉素的载药率和包封率分别可以达到 17.6%和80%。通过提高盐酸阿霉素的投入量，可以增加盐酸阿霉素的载药率。
[0156]表1
[0159] 实施例6
[0160] 本实施例用于说明金钆复合纳米材料载药前后的吸收光谱的变化。
[0161] 各取200yL实施例1中制备的金钆复合纳米材料及实施例5中制备的载药材料(盐 酸阿霉素投入浓度为〇. 2mg/mL)，水洗一次，稀释1倍，用酶标仪检测溶液在400-1000nm波长 下的吸收光谱。如图4所示，金IL复合纳米载体的最大吸收峰在805nm，载阿霉素并修饰透明 质酸或透明质酸钠后最大吸收峰为820nm，且在480nm处出现明显的阿霉素吸收峰。
[0162] 实施例7
[0163] 本实施例用于说明金钆复合纳米载药材料在不同pH和有无激光照射下的释药行 为。
[0164] 取3份0.5mL实施例5中制备的载药材料(盐酸阿霉素投入浓度为0.2mg/mL)，离心 去上清液，分别用pH = 4.5、pH = 6.0和pH = 7.4的磷酸缓冲液(PBS)分散，然后37°C水浴孵 育。每隔一定时间间隔进行离心，取走上清液并用酶标仪测量上清液中阿霉素含量，残余物 用相同体积和PH的PBS重新分散，继续37°C进行释药反应。激光照射释药实验采用相似的步 骤进行，激光条件为808nm波长、0.8W功率、5mm光斑直径。溶液温度通过热像仪监测，0.8W激 光照射溶液最终温度升到45°C，每个时间点先用激光照射5min使溶液温度升到45°C，然后 继续37°C水浴孵育。如图5所示，阿霉素在酸性条件下比中性条件下释药更快更多(pH 4.5 比pH 5.0释药快，pH 5.0比pH 7.4释药快），并且激光照射引起升温能促进药物释放。
[0165] 实施例8
[0166] 本实施例用于说明金钆复合纳米载药材料在37°C水浴、不同pH、有无透明质酸酶 存在下的释药行为。
[0167] 取3份0.5mL实施例5中制备的载药材料(盐酸阿霉素投入浓度为0.2mg/mL)，离心 去上清液，分别用pH 7·4、ρΗ 6.0含lmg/mL透明质酸酶、pH 4.5含lmg/mL透明质酸酶的PBS 分散，然后37°C水浴孵育。每隔一定时间间隔进行离心，取走上清液并用酶标仪测量上清液 中阿霉素含量，残余物用相同体积和PH的PBS重新分散，继续37°C进行释药反应。如图6所 示，阿霉素在酸性且有透明质酸酶的存在下比中性条件下释药更快更多。
[0168] 实施例9
[0169] 本实施例用于说明金钆复合纳米材料本身对人乳腺癌MDA-MB-231细胞活力的影 响。
[0170] 1)细胞培养
[0171] 将人乳腺癌MDA-MB-231细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM或1640液体培养基 中，置于37 °C、5 %二氧化碳的培养箱中培养。
[0172] 2)细胞活力测定
[0173] 以6000细胞/孔密度，将细胞接种于96孔板中。贴壁24h后，加入含浓度为0、10、50、 100、200yg/mL的金钆复合纳米材料(来自实施例1)的DMEM或1640液体培养基(含有10%胎 牛血清）。处理24h后撤掉培养基，每孔加入IlOyL含10% (体积比）CCK-8的细胞培养液，在培 养箱中孵育2h后，在酶标仪上测定450nm处吸光度值，600nm作为参比波长。每组吸光度值扣 除空白溶液吸光度值后，每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。每组设置6个平 行孔。细胞活力测定结果如图7所示，本发明所述的金钆复合纳米载体在200yg/mL浓度范围 以内没有检测到毒性。
[0174] 实施例10
[0175] 本实施例用于说明金钆复合纳米载药材料的靶向性及其在肿瘤细胞内的定位情 况。
[0176] 1)细胞培养
[0177] 将人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞分别接种于35mm共聚焦成像培养皿中，用含 有10%胎牛血清的DMEM或1640培养基于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养24h。然后用PBS 洗涤两次，加入含5ymol/L阿霉素或实施例5中制备的含5ymol/L等效阿霉素的金钆复合纳 米载药材料的培养基，分别处理细胞30min、3h和12h。
[0178] 2)细胞内定位的测定
[0179] 丢弃细胞培养基，用I3BS洗涤细胞三次，加入无血清无酚红DMEM或1640培养基，用 激光共聚焦显微镜下观察阿霉素的荧光。图8和图9显示了载药材料分别孵育30min、3h和 12h后，用含100nmol/L的溶酶体染料(LysoTracker Green)的无血清DMEM或1640培养基37 °(：孵育细胞45min后的细胞定位图像。图8a-c显示金钆复合纳米载药材料在MDA-MB-231细 胞的摄入和定位情况，30min时部分金IL复合纳米载药材料位于细胞膜上，少量金IL复合纳 米载药材料进入细胞内和溶酶体共定位;3h时更多的金IL复合纳米载药材料进入细胞内和 溶酶体共定位;12h时部分金钆复合纳米载药材料仍和溶酶体共定位，此时已有大量阿霉素 从载药材料中释放出来进入到了细胞核内。图9a-c显示金钆复合纳米载药材料在MCF-7细 胞的摄入和定位情况，和图8a-c相比，MCF-7细胞对金钆复合纳米载药材料的摄入量在 30min、3h和12h时都比相应时间点的MDA-MB-231细胞对载药材料的摄入量低很多。由于透 明质酸或透明质酸钠能靶向肿瘤细胞表面的CD44受体，MDA-MB-231细胞表面高表达CD44受 体，MCF-7细胞表面低表达⑶44受体，因此MDA-MB-231细胞对载药材料的摄入量比MCF-7细 胞高很多，体现出了载药材料的靶向性。
[0180] 实施例11
[0181] 本实施例用于说明金钆复合纳米材料可以用于X射线计算机断层扫描(CT)成像。
[0182] 将实施例1中制备的金钆复合纳米材料溶液，离心甲醇洗一次，水洗一次，浓缩60 倍，材料浓度是45mg/mL，Au浓度是9mg/mL，再分别稀释2倍(Au浓度是4.5mg/mL)、4倍(Au浓 度是2 · 25mg/mL)、8倍(Au浓度是 1 · 13mg/mL)、16倍(Au浓度是0 · 56mg/mL)和32倍(Au浓度是 0.28mg/mL)，各取出0.5mL置于0.5mL小离心管中，测量材料的CT信号。图IOa显示了不同浓 度材料的CT成像图，图IOb是CT信号强度与Au浓度的关系图，可以看出两者显示出了很好的 线性关系(R 2 = O.9954)。因此，金钆复合纳米材料可作为一种很好的CT造影剂，用来进行生 物成像。
[0183] 实施例12
[0184] 本实施例用于说明金钆复合纳米材料可以用于核磁共振(MRI)成像。
[0185] 将实施例1中制备的金钆复合纳米材料溶液，离心甲醇洗一次，水洗一次，用水稀 释4倍，材料浓度是62yg/mL，Gd浓度是0.072mM，再分别稀释2倍(Gd浓度是0.036mM)、4倍(Gd 浓度是0. 〇18mM)、8倍(Gd浓度是0.009mM)，各取出0.5mL置于0.5mL小离心管中，测量材料的 MRI信号。图IIa显示了不同浓度材料的MRI T1成像图，图IIb是MRI信号强度与Gd浓度的关 系图，可以看出两者显示出了很好的线性关系(R 2 = O.9949)。因此，金钆复合纳米载体可作 为一种很好的MRI造影剂，用来进行生物成像。
[0186] 实施例13
[0187] 本实施例用于说明激光照射能增加金钆复合纳米材料在肿瘤部位的富集和渗透。
[0188] 将1*107个人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于4-6周balb/c裸鼠的背上，等肿瘤体积 长到150mm 3时进行实验。老鼠麻醉后，静脉注射200yL PBS分散的金钆复合纳米材料(实施 例Ia制备），然后马上用808nm连续波激光（IW，光斑直径5mm)照射15min，再通过光声成像观 察材料在肿瘤的富集和渗透。如图12a-b所示，激光照射能明显增加金钆复合纳米材料在肿 瘤部位的累积和渗透。注射材料不照激光的老鼠作为对照（图12c_d)。
[0189] 实施例14
[0190] 本实施例用于说明荷瘤小鼠静脉给药后的抑瘤结果。
[0191] 1)老鼠接种肿瘤
[0192] 将1*107个人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于4-6周balb/c裸鼠的右后腿上，5天后 肿瘤体积达到IOOmm 3左右，进行激光治疗实验。
[0193] 2)抑瘤实验
[0194] 200yL的实施例1中制备的金钆复合纳米材料溶液（3.2mg/mL，Au含量是650yg/ mL)，实施例3中的金钆复合纳米载药材料(Au含量是650yg/mL，等效盐酸阿霉素浓度是 0.8mg/mL)，PBS和0.8mg/mL盐酸阿霉素溶液经尾静脉注射给步骤1中的小鼠，然后马上用 808nm连续波激光（1W，光斑直径5mm)照射肿瘤15min，用热像仪监测升温过程。低温组(Au-Dox-Low)最高温度最终升温到45°C，高温组(Au-Dox-High)最高温度最终升温到50 °C。尾静 脉注射载药材料但不照激光的老鼠(Au-Dox)作为对照。激光照射后的第二天用游标卡尺测 量肿瘤的大小，往后每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的大小，一直监测21天。21天时，处死老 鼠，取出肿瘤称重。图13a是用肿瘤重量表示的抑瘤结果，可以看出载药组(Au-Dox)和阿霉 素组(Dox)的抑瘤率差不多，载药照激光组(Au-Dox-Low和Au-Dox-High组)和载药组(Au-Dox)相比有显著性差别（*P〈0.05，#P〈0.01)，且明显抑制了肿瘤的生长。图13b将载体照激 光组、载药组、载药照激光低温组的抑瘤率进行了分