-6倍；
[0150] 培养第21天，P3代细胞扩增的倍数可以达到10倍。
[0151] 实施例2脂肪干细胞分化的免疫染色分析（成脂诱导对照及油红0染色实验）
[0152] 将haMPCs以I. 5X IO5ceIls/孔的密度接种在六孔板中，以正常培养基培养的样 本为成脂分化实验阴性对照组。具体方法是：向基础培养基（DMEM+10%胎牛血清）中加入 1 μ mol/L的地塞米松、10 μ mol/L的胰岛素、200 μ mol/L的Π引哚美辛和〇· 5mmol/L的异丁基 甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，每周换2次液，直到进行成脂染色观察为止，以上对照 组均做平行实验（η = 3)。
[0153] 用0.5 %油红0,对成脂诱导后的各组样本进行染色。具体操作方法是：先用 D-hanks将样本细胞冲洗充分，然后加入油红稀释染色10~15min。以每组样本随机选取 5~10视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。
[0154] 结论：该结果表明脂肪来源干细胞在成脂诱导剂作用下，脂肪间充质祖细胞能够 生成脂质，具有分化为脂肪细胞的能力，图1为脂肪细胞分化的油红〇染色；图2为脂肪细 胞分化的油红〇染色对照组（阴性）；图中的红色为脂滴，可以看到成脂分化后的细胞内出 现大量密集在一起的小脂滴。
[0155] 实施例3 haMPC的流式检测和PRP的表面抗原检测
[0156] 通过酶消化法将细胞收集到离心管中，细胞悬液调整密度为lX105cell S/mL， 1，800r/min (120g)离心5min，弃掉上清，用4°C的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬 液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至ImL,加入抗体5~ 10 μ L，避光，冰上放置30min。用D-Hanks冲洗，离心，弃上清，重复该冲洗过程2~3次，确 保将未结合抗体除净。最后，加入约200至300 μ L的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检 测。
[0157] haMPC流式检测结果，haMPC流式检测试验图谱如图3所示；
[0158] I型胶原酶消化方法分离、培养的P3代细胞MSCs表面抗原流式鉴定结果：
[0159]
[0160] 结论：
[0161] 该结果表明：通过流式细胞仪对脂肪间充质祖细胞进行细胞表面抗原标记表达的 分析该细胞纯度高，大部分为脂肪间充质祖细胞，其中CD34、CD45为间充质祖细胞的阴性 己。
[0162] 细胞分泌因子的检测
[0163] 将haMPC在特定培养室培养48h，取上清做检测。取脐带干细胞为对照组
[0165] 以上结果说明，haMPC混合物分泌的细胞因子大于其它类型干细胞，更有利于细 胞的修复。
[0166] PRP检测结果
[0167] 血小板检测
[0168] 经2次离心后，对收集的PRP进行检测，血小板浓度范围为（7. 5~10. 0) X IO11/ L0
[0169] 细胞因子检测
[0170] 加入含凝血酶500U/mL的10 % CaC12,按10:1 (v/v)与PRP混合，室温静置 lOmin，离心12000r/min，5min，提取萃取液。ELISA检测PRP中PDGF (样品稀释2000倍）、 TGF- β (样品稀释1000倍）、VEGF (样品不稀释）浓度，酶标仪检测样品光密度OD值。
[0172] 结论：PRP能分泌大量的细胞因子，如TOGF、TGF-β、VEGF等。
[0173] 流式细胞仪检测血小板活化率
[0174] 上述离心方法提取PRP后，加上未做任何处理（未激活、未离心）的抗凝全血作为 空白组。每1〇〇μ 1样品中加入20μ I CD41-FITC和20μ I CD62p-PE，4°C避光，15min，流式 细胞仪检测样品中活化血小板的百分比。富含血小板的血浆流式检测试验图谱如图4所示 (A为空白组；B为PRP组）。
[0176] 结论：上述离心法提取的血小板与空白组无明显差异，该方法提取的PRP中⑶41 阳性血小板较少。
[0177] CCK-8法检测PRP对haMPC增殖能力的影响
[0179] (4% PRP 组比较 0· 5% PRP 组合空白组，P <0· 05)
[0180] 结论：PRP能促进haMPC的增殖，且当PRP的浓度在0. 5%~4%范围内时，所述促 进作用随浓度增加而增加。
[0181] 实施例4富含血小板的血浆与haMPC组合对乙肝的治疗效果
[0182] 将收获的细胞注入30ml生理盐水，制备成细胞悬液，以备回输使用。
[0183] 乙肝患者2例，细胞制备成功后，静脉注射，细胞量> 108,每周注射一次，连续四 周。回输前以及回输后的第3个月，6个月分别进行做临床效果评分评估脂肪间充质祖细胞 复合物治疗乙肝的疗效。抽血检测乙肝五项，乙肝病毒DNA以及ALT.其结果如下：
[0184] 患者1，男性，49岁，2011年1月诊断为慢性乙肝并肝功能异常，于2011年7月接 受PRP+haMPCs制剂回输治疗，治疗前后检测指标具体如下：
[0187] 患者2,男性，39岁，2011年10月诊断慢性乙型肝炎，于2012年4月首次接受 PRP+haMPCs细胞回输治疗，治疗前后检查指标具体如下：
[0189] 从以上结果看出，富含血小板的血浆与haMPC的细胞混合物对于乙肝有治疗作 用，可以使表面抗原下降，病毒DNA减少，并减低ALT，促进肝功能的修复。
[0190] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆组合物的用途，其特征在于，用于制备 治疗乙肝的药物组合物。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括：脂肪间充质祖细 胞、富含血小板的血浆，和药学上可接受的载体。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的治疗包括选自下组的一项或多项指 标改善： 乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体、乙肝病毒DNA， 和 ALT。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组的 任一或多种特征： (i) 80%以上的细胞具有表面抗原⑶29 ; (ii) 70%以上的细胞具有表面抗原⑶73 ; (iii) 60%以上的细胞具有表面抗原⑶105 ; (iv) 70%以上的细胞具有表面抗原⑶90。5. 如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的脂肪间充质祖细胞具有选自下组 的任一或多种特征： (v) 在细胞群中，10%以下的细胞具有表面抗原CD34; (vi) 在细胞群中，10%以下的细胞具有表面抗原CD45。6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的富含血小板的血浆含有选自下组的 细胞因子：干细胞生长因子（HGF)，血管内皮生长因子（VEGF)、血小板衍生因子（PDGF)、 人转化生长因子β (TGF-β)、巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)、白介素-2(IL-2)、白介 素-10 (IL-10)、或其任意组合。7. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的富含血小板的血浆包括选自下组的 一个或多个特征： 红细胞的浓度为彡5X 105/mL ; 血小板浓度范围为〇. 5X 106-1. 5X 101Q/mL ; 白细胞和红细胞的总浓度为彡10X105/mL。8. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的富含血小板的血浆中含有一种或多 种选自下组的细胞因子：roGF、TGF-0、VEGF。9. 一种用于预防或治疗肝炎的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：有 效量的脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆，以及药学上可接受的载体；较佳地，所述的 药物组合物为静脉注射试剂。10. -种用于预防或治疗肝炎的药物组合试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：月旨 肪间充质祖细胞，富含血小板的血浆，药学上可接受的载体，和说明书；且所述的说明书记 载了使用方法。
【专利摘要】本发明涉及脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆在预防或治疗肝炎中的用途。具体地，脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆可用于制备治疗乙型肝炎的药物组合物。给需要的对象施用所述的药物组合物，可以使乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体等指标改善，并显著减少肝炎病毒DNA，降低ALT，从而促进肝功能的修复。
【IPC分类】A61K35/16, A61K35/35, A61P31/20, A61P1/16
【公开号】CN105640993
【申请号】
【发明人】曹卫, 张丽, 戴成祥, 刘佳, 蔡松柏, 郑成小
【申请人】西比曼生物科技（上海）有限公司, 西比曼生物科技（无锡）有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月20日