度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克 隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或（Fab)2片段；抗体重链； 抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子（Ladner等人，美国专利No. 4, 946, 778);或嵌合抗 体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的 抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。
[0103] 药物组合物
[0104] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的脂肪间充质祖细胞、富含血小 板的血浆，以及药学上可接受的载体。
[0105] 通常，可将脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆配制于无毒的、惰性的和药学 上可接受的水性载体介质中，如生理盐水中，其中pH通常约为5-8,较佳地，pH约为7-8。
[0106] 如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或活 性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0107] 如本文所用，"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上 可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0108] 本发明的药物组合物含有安全有效量的脂肪间充质祖细胞、富含血小板的血浆， 以及药学上可接受的载体。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、 乙醇、及其组合。通常，药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针 剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述 的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂 还可制成缓释制剂。
[0109] 本发明所述脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的有效量可随给药的模式和 待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据 各种因素来确定（例如通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述药代动力学参数 例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免 疫状况、给药的途径等。
[0110] 本发明的药物组合物优选为静脉注射试剂。在另一优选例中，所述的皮下注射试 剂中脂肪间充质祖细胞的浓度为IX 105-2X IO9个/ml，较佳地为IX IO6-IX IO9个/ml，更 佳地为 IX IO7-IX IO8 个 /ml。
[0111] 本发明的主要优点：
[0112] (1)脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的组合对于肝炎（特别是乙肝）有显 著的预防或治疗作用，特别是表现为乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗 体、乙肝核心抗体等乙肝病毒相关指标的逆转。
[0113] (2)脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的组合使乙肝细胞多种表面抗原下 降，病毒DNA显著减少，并减低谷丙转氨酶ALT。
[0114] (3)脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的组合可以促进肝功能的修复。
[0115] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0116] 实施例1 haMPC的制备
[0117] 1.无菌手术器械及耗材
[0118] (1)无菌长柄手术镊子5把
[0119] (2)无菌100目滤网
[0120] (3)灭菌40目滤网
[0121] (4) 50ml 离心管
[0122] (5)T175、T75 培养瓶
[0123] (6) TlOml、T25ml 移液管
[0124] (7)宽口吸头移液管
[0125] 2.无菌试剂：
[0126] (1)DMEM(无血清培养基）MSC SFM 培养基（life)
[0127] (2) I型胶原酶（现配现用）：0. 1 %胶原酶I配制方法：称取0.1 g胶原酶I粉末溶 解于100mL未加任何因子的培养基中，用之前37°C进行预热。
[0128] (3)氯化钠注射液
[0129] (4)0. 125% Trypsin-0. 01% EDTA 溶液
[0130] (5)lg/L 枸橼酸钠
[0131] 脂肪间充质祖细胞制备：
[0132] 1.接收脂肪组织，用75%的酒精擦拭装脂肪组织的容器外壁；
[0133] 2.分装脂肪组织，每一个T175培养瓶分装脂肪组织为50ml。IOml移液管，去吸 头，于脂肪采集瓶中先吸取下层红色液体弃掉，剩余上层脂肪混匀后进行分装。
[0134] 3.洗涤脂肪组织，除去血细胞。向T175培养瓶中加入100mL氯化钠注射液，拧紧 盖子，剧烈晃动3分钟以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5分钟，使不同相分离，吸去下层水 相；重复以上操作三次，直到下层液变为清澈。
[0135] 4.胶原酶I消化：加入等量新配制的预热（提前半小时于37°C的气浴摇床预热） 的胶原酶I溶液，封口膜封口，剧烈晃动培养瓶5~10秒，置于振动气浴锅中，37°C，70rpm， 消化60分钟，每隔15分钟剧烈晃动培养瓶5~10秒，直到看起来较为平滑。
[0136] 5.分离基质血管组分（SVF):将消化后的组织用无菌40目滤网分装到50ml的离 心管中，室温400g离心10分钟，得到的沉淀即为SVF。
[0137] 6.净化沉淀：离心后，SVF沉积于离心管底部，用移液管自上而下小心除去上层油 脂和下层的胶原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免扰动沉淀细胞。适量 生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g，10分钟离心。离心完毕，小心吸去上清液，不能直接倒 掉。吸取时移液管头应该置于离心管的上部以便于彻底的除去油。IOml培养基悬浮细胞， 然后将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次室温300g，10分钟离心。
[0138] 7.细胞种植：离心后加20ml培养基充分混匀。基于组织块法：根据培养瓶的面积 进行细胞种植。按照每平方厘米接种〇. 16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养 瓶中接种12ml抽脂脂肪量。即每100mL脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶。进行未 处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞。
[0139] 8.原代细胞培养：
[0140] 8. 1平置培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱。培养条件： 37±0. 5°C，二氧化碳体积分数为5±0. 2%。
[0141] 8. 2换液：原代培养第24小时，进行全量换液。此后每隔3天全量换液，放置二氧 化碳恒温恒湿培养箱进行培养。
[0142] 9.原代细胞收获：7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70%~ 80 %时，消化收获。
[0143] 9. 1原代细胞收获：在培养瓶中加入消化酶（消化酶为0. 125% Trypsin-0. 01% Η)ΤΑ溶液，使用前室温（20~25°C )放置15~25min，每75cm2加入2ml消化酶溶液），消 化时间为1. 5~2. 5min，加入培养基2~3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落，移入50ml 离心管中，原培养瓶中加入4~5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，加入离心管中定容至50ml，移 液管吹打悬浮后，100目无菌滤网过滤，过滤液收集到50ml离心管中，lOOOrpm，IOmin离心 洗涤。
[0144] 9. 2原代细胞传代：观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中 细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀， 取样计数。计数后lOOOrpm，IOmin二次离心。去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻 轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000~6000个/cm 2， 即（3.75~4.5)\105个〇6118八75，按照4.5\105个〇6118八75进行传代。在培养容器上 标示细胞代数与培养时间等信息。将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养。 培养条件：二氧化碳恒温恒湿培养箱。条件：37±0. 5°C，二氧化碳体积分数为5±0. 2%。培 养至细胞融合达85 %~90 %。
[0145] 富血小板血浆的制备：
[0146] 应用二次离心法，用装有Iml枸橼酸钠抗凝剂的注射器一次性采静脉血，离心7分 钟（1200r/min)，液体分为上清液层和红细胞层，收集上清液及与其交界面下约2mm液体， 二次离心9min(3740r/min)，下层为橙黄色的PRP，约2~3ml即为PRP。进行血小板计数， PRP血小板含量达到或超过全血4倍左右，则为达到要求的PRP。
[0147] 经上述方法分离的细胞得率：5X105~lX106cells/ml脂肪；
[0148] 培养第7天，Pl代细胞扩增的倍数可以达到1-2倍；
[0149] 培养第14天，P2代细胞扩增的倍数可以达到4