充质祖细胞的浓度为 0. 1-100 X IO7 个 /ml,较佳地为 1-10 X IO7 个 /ml,更佳地为 2-5 X IO8 个 /ml。
[0059] 在另一优选例中,所述的静脉注射试剂中富含血小板的血浆的浓度为 10v% -20v%。
[0060] 在另一优选例中,所述的注射试剂的体积为30-70ml。
[0061] 本发明的第二方面,提供了一种用于预防或治疗肝炎的药物组合试剂盒,所述的 试剂盒包括:脂肪间充质祖细胞,富含血小板的血浆,药学上可接受的载体,和说明书;且 所述的说明书记载了使用方法。
[0062] 在另一优选例中,所述的使用方法包括:将脂肪间充质祖细胞,富含血小板的血浆 和药学上可接受的载体混合制成制剂,并对治疗对象施用。
[0063] 在另一优选例中,所述的制剂是注射剂。
[0064] 本发明的第三方面,提供了一种预防或治疗肝炎的方法,所述方法包括步骤:给需 要的对象施用含有:(a)脂肪间充质祖细胞或脂肪间充质祖细胞群、或含有脂肪间充质祖 细胞或脂肪间充质祖细胞群;和(b)富含血小板的血浆的药物组合物。
[0065] 在另一优选例中,所述的对象为人或非人哺乳动物。
[0066] 在另一优选例中,所述的非人哺乳动物为鼠、兔、牛、羊、猪等。
[0067] 在另一优选例中,所述的施用方法为静脉回输。
[0068] 应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0069] 图1脂肪细胞分化的油红0染色;
[0070] 图2脂肪细胞分化的油红0染色对照组(阴性);
[0071] 图3 haMPC流式检测试验图谱;
[0072] 图4富含血小板的血浆流式检测试验图谱(A为空白组;B为PRP组)。
【具体实施方式】
[0073] 本发明人经过长期而深入的研究,意外地发现,脂肪间充质祖细胞和富含血小板 的血浆组合物具有极其优异的预防或治疗肝炎(尤其是乙型肝炎)的作用。具体地,给需 要的对象施用本发明的含有脂肪间充质祖细胞和富含血小板的血浆的药物组合物,对于肝 炎有显著的预防或治疗作用,可以使多种表面抗原下降,病毒DNA显著减少,并减低ALT,促 进肝功能的修复。在此基础上,发明人完成了本发明。
[0074] 术语
[0075] 如本文所用,术语"以上"和"以下"包括本数,例如"95%以上"指彡95%,"0. 2% 以下"指彡0.2%。
[0076] 乙型肝炎
[0077] 乙型病毒性肝炎,简称乙肝,是一种由乙型肝炎病毒(HBV)感染机体后所引起的 疾病。
[0078] 乙肝病毒宿主范围狭窄,且具有明显的嗜肝性,体外培养难度大。乙型肝炎模型涉 及乙肝病毒感染及感染后机体免疫反应,因此在治疗过程中不仅需要修复肝脏受损细胞, 还需要抑制体内病毒复制及调节免疫反应,与非病毒性肝炎有较大的区别。目前,动物模型 主要利用免疫缺陷的动物制成人HBV动物模型。其要求主要是与人临床肝炎特征相似,病 毒血症以及血液中免疫学指标维持一定时间,在最大程度上还原乙肝病毒感染人体的疾病 状态。而非病毒性肝炎模型,例如酒精性肝病模型、药物性肝炎模型等直接通过饮食或药物 进行干预,损伤动物肝脏细胞功能,模拟人体肝炎的临床表现。
[0079] 常见的乙肝检测指标"乙肝五项"包括乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、e抗原、e抗 体、核心抗体。表面抗原是乙肝病毒的外壳蛋白质,自身不具有传染性,但它的出现常伴随 着乙肝病毒的存在,因此它的阳性为已经感染乙肝病毒的标志。通常在感染病毒后2-6个 月,血清转氨酶还未上升时,便可在血清中测到阳性。急性乙肝患者绝大多数可以在病程初 期转阴,但慢性乙肝患者会持续阳性。表面抗体是体内对乙肝病毒免疫和保护性抗体,多在 恢复期出现阳性。与此同时,接受乙肝注射疫苗者,绝大多数也呈阳性。e抗原通常在乙肝 病毒感染后,表面抗原阳性同时,或其后数天便可测得阳性。e抗体阳性在抗原转阴后数月 出现。核心抗体一般在表面抗原出现后3-5周,乙肝症状出现前便会在血清中检查出来。
[0080] 本发明中,对于乙肝的治疗主要针对于逆转乙肝五项等乙肝病毒相关指标,包括 (但并不限于):乙肝表面抗原、乙肝表面抗体、乙肝e抗原、乙肝e抗体、乙肝核心抗体、乙 肝病毒DNA,和ALT。
[0081] 脂肪
[0082] 自体脂肪是整形和抗衰老治疗的优良来源,脂肪组织材料可以来源于腰部、臀部、 腹部、大腿、上臂等部位。本领域技术人员可采用通用的技术方法获得自体脂肪组织,包括 (但不限于)抽吸、手术分离等方法。
[0083] 在本发明中,脂肪组织或脂肪原料没有特别限制,可以是来源于动物或人的任何 部位的脂肪组织,优选人的脂肪组织。较佳地,脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂 等部位的组织。
[0084] 富血小板血浆(PRP)
[0085] 富血小板血浆是从全血中提取的血小板含量超过全血4~5倍的血浆,研究表 明PRP体外激活后,其中的血小板α颗粒可释放出多种生长因子,如血小板衍化生长因 子(platelet derived growth factor, PDGF)、转化生长因子-β (transforming growth factor-i3,TGF_i3)、膜岛素样生长因子(insulin-1 ike growth factor, IGF)和表皮生长 因子(epidemal growth factor,EGF)等。PRP激活后形成的凝胶状物质又被称为血小板 胶(autologous platelet gel, APG),研究认为参与机体组织的修复如减少出血、抗感染、 加速组织愈合、骨组织再生等。故近年来被应用于外科领域包括牙周病、种植义齿及口腔颌 面外科等。
[0086] PRP源于自体,无免疫反应;含大量生长因子,且比例近似正常生理状态,能充分 发挥各生长因子的协同作用;在凝血酶作用下易生成凝胶;良好的止血功能有利于创口愈 合和组织再生、减少瘢痕,减轻疼痛;且制取容易,成本低。
[0087] 研究发现,PRP能够使脂肪间充质祖细胞保持幼稚梭形状态,从而促进其增殖的作 用,在不同的生理环境中PRP协同细胞在特定的局部环境中想特定的功能细胞分化,表现 特定的功能。因此,PRP促进组织修复的作用可能是为组织修复提供能多的前体细胞,或是 刺激存在于不同组织中的干细胞如骨髓干细胞、毛囊干细胞、脂肪干细胞等大量增殖,这些 幼稚细胞大量生成的同时,又有其他因子根据创伤的部位、范围等诱导这些幼稚的细胞向 不同的组织类型分化修复创伤,完成复杂的机体修复的过程。
[0088] 但是,PRP中各生长因子间作用机制尚不清楚,且一些基础研究、动物实验和临床 疗效之间出现相反结果,使PRP的有效性受到质疑,因此限制了其在临床的应用。
[0089] 脂肪间充质祖细胞(Human adipose derived mesenchymal progenitor cells)
[0090] 脂肪来源的间充质祖细胞(Human adipose derived msenchymal progenitor cells, haMPCs):不含CD34+细胞,SVF培养P3-P10代纯化扩增获得。
[0091] 在本发明中,脂肪间充质祖细胞的制备方法可以包括步骤:洗涤脂肪组织,然后用 胶原酶消化,离心分离基质血管成分,除去油脂和胶原酶,培养原代细胞,得到传代后的脂 肪间充质祖细胞。
[0092] 脂肪间充质祖细胞的抗原检测
[0093] 用本发明使用的脂肪间充质祖细胞具有很高的纯度,基本上不含有其他类型的细 胞或干细胞。这可通过细胞表面抗原的检测加以验证。
[0094] 脂肪间充质祖细胞具有多种特异性抗原和受体,主要有⑶3、⑶13、D29、⑶34、 CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC 等。
[0095] ⑶34抗原是一种高度糖基化I型跨膜蛋白,它选择性的表达于人类造血干细胞 (HSC),祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面,带有CD34的脂肪间充质祖细胞在总干细胞 的比例优选为彡0. 2%,更佳地,彡0. 2%。
[0096] ⑶45存在于所有造血细胞的表面,包括造血干细胞和破骨细胞。带有⑶45的脂肪 间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为< 〇. 1%。
[0097] ⑶29、⑶73、⑶49d、⑶90等主要存在于脂肪间充质祖细胞表面。
[0098] 带有⑶29的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为彡80%,更佳地彡90%。
[0099] 带有⑶73的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为彡70%,更佳地彡80%。
[0100] 带有⑶105的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为> 60%,更佳地 彡 70%〇
[0101] 带有⑶90的脂肪间充质祖细胞在总干细胞的比例优选为彡70%,更佳地彡80%。
[0102] 本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪间充质祖细胞的纯度和分化程