血经 淋巴细胞分离液密度梯度400g离心20分钟，分离获得单个核细胞，单个核细胞以5 X IO6个 细胞/mL与冻存液混合放入lmL、5mL冻存管中。
[0101] 将冻存管放入程序降温盒或放入-80°C深低温冰箱10小时，再放入液氮罐(-196 °C )中存储30分钟，然后转入-20°C环境下放置2小时，再放入-80°C深低温冰箱8小时，再转 入液氮罐中存储。
[0102] 取出冻存管快速置于37°C水浴1分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋 巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
[0103] 实施例9:采用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液进行免疫细胞的冻存
[0104] 脐带血经2500转/分钟，离心15分钟，分离去除上层血浆于-20°c备用，下层浓血经 淋巴细胞分离液密度梯度400g离心25分钟，分离获得单个核细胞，单个核细胞以7 X IO6个 细胞/mL与冻存液混合放入lmL、5mL冻存管中。
[0105] 将冻存管放入程序降温盒或放入-80°C深低温冰箱11小时，再放入4 °C环境中放置 30分钟，然后转入-20°C环境下放置2.5小时，再放入-80°C深低温冰箱9小时，再转入液氮罐 中存储。
[0106] 取出冻存管快速置于38°C水浴1.5分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以 淋巴细胞无血清培养基洗涤3次，即可。
[0107] 实施例10:采用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液进行免疫细胞的冻存
[0108] 外周血经3000转/分钟，离心20分钟，分离去除上层血浆于-20°C备用，下层浓血经 淋巴细胞分离液密度梯度400g离心30分钟，分离获得单个核细胞，单个核细胞以8 X IO6个 细胞/mL与冻存液混合放入lmL、5mL冻存管中。
[0109] 将冻存管放入程序降温盒或放入-80°C深低温冰箱12小时，再放入液氮罐(-196 °C )中存储30分钟，然后转入-20°c环境下放置3小时，再放入-80°c深低温冰箱10小时，再转 入液氮罐中存储。
[0110] 取出冻存管快速置于40°c水浴3分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，经离心，以淋 巴细胞无血清培养基洗涤2次，即可。
[0111] 使用实施例1-7和对比例1-4的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12个月 后，其复苏后的NK细胞活性(冻存密度I. 〇 X IO6个细胞/ml)结果如表1所示。
[0112] 表1
[0114] 由表1可以看出：使用实施例1-7的免疫细胞冻存液冻存1个月、3个月、6个月和12 个月后复苏的NK细胞活性均在93%以上，其中，实施例4-5冻存的NK细胞复苏后的活性高于 实施例1-3和实施例6-7的免疫细胞冻存液，另外，实施例1-7的免疫细胞冻存液冻存1个月、 3个月、6个月和12个月后复苏的NK细胞均没有可见异物、细菌、真菌、细菌内毒素、支原体的 污染。
[0115] 通过将实施例1-7与对比例1-4进行比较可以得出，采用实施例1-7的免疫细胞冻 存液可以使细胞复苏后取得更好的细胞活性，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细 胞的生物学活性。
[0116] 通过上述实施例可以说明，采用本发明的免疫细胞冻存液能够使细胞复苏后的存 活率达到93%以上，有效解决了免疫细胞无法存储、长时间运输的问题，实现了本地采集、 异地制备、本地存储、即时复苏的应用。
[0117] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但 本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征 以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发 明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围 和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种免疫细胞冻存液，其特征在于，其包括以下组分:重组人白介素-2、聚乙二醇、1， 2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠。2. 如权利要求1所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液包括:重组 人白介素-250-200U/mL;聚乙二醇0 · 1-0 · 4g/mL; 1，2-丙二醇0 · 2-0 · 4g/mL;基础培养基或注 射用氯化钠90-99体积％ ; 优选地，所述免疫细胞冻存液包括:重组人白介素-280-180U/mL;聚乙二醇0.2-0.4g/ mL; 1，2-丙二醇0.25-0.4g/mL;基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。3. 如权利要求1或2所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为RPMI-1640 培养基或淋巴细胞培养基； 优选地，所述淋巴细胞培养基为GT-T551培养基或GT-T561培养基。4. 如权利要求1-3任一项所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液还 含有Ultroser G、自体血衆或胎牛血清中的任意一种； 优选地，所述Ultroser G的含量为0.2-1.8g/mL; 优选地，所述自体血浆的含量为10-90体积％ ; 优选地，所述胎牛血清的含量为10-90体积％。5. 如权利要求1-4任一项所述的免疫细胞冻存液，其特征在于，所述免疫细胞冻存液进 一步含有人血白蛋白或丙三醇； 优选地，所述人血白蛋白的含量为0.05-10. lg/mL; 优选地，所述丙三醇的含量为10-20体积％。6. 如权利要求1-5任一项所述的免疫细胞冻存液在免疫细胞冻存复苏中的应用，优选 地，所述免疫细胞为T细胞、自然杀伤细胞或NTK细胞中的任意一种。7. -种免疫细胞的冻存方法，其特征在于，其包括： (1) 将免疫细胞与权利要求1-5任一项所述的免疫细胞冻存液混合;和 (2) 进行程序降温至-80°C，然后转移至液氮中冷冻保存。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 冻存液的制备:制备如权利要求1-5任一项所述的免疫细胞冻存液； (2) 细胞悬液的制备:将供体资源离心后，分离去除上层血浆，并将下层浓血离心，分离 获得免疫细胞，将所述免疫细胞与所述免疫细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻 存管中； (3) 冷冻:将所述冻存管进行程序降温至_80°C，然后转移至液氮中冷冻保存； (4) 细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40°C水浴1-3分钟，振荡直至细胞悬液完全融 化，经离心，以淋巴细胞无血清培养基洗涤2-3次，即可。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述供体资源为外周血或脐带血； 优选地，所述离心的转速为2000-3000转/分钟;所述离心的时间为10-20分钟； 优选地，所述细胞悬液的浓度为5-10 X 106个细胞/mL，优选为7 X 106个细胞/mL。10. 如权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为外周血单个核细 胞，优选为T细胞、自然杀伤细胞或NKT细胞中的任意一种。
【专利摘要】本发明涉及一种免疫细胞冻存液及其应用，所述免疫细胞冻存液包括重组人白介素-2、聚乙二醇、1,2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠；具体的，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-250-200U/mL；聚乙二醇0.1-0.4g/mL；1,2-丙二醇0.2-0.4g/mL；基础培养基或注射用氯化钠90-99体积％。通过将本发明所述的免疫细胞冻存液用于免疫细胞冻存，可使复苏细胞存活率达到93％以上，细胞生物学特性不发生变化，保证了免疫细胞的生物学活性；另外，由于免疫细胞冻存液中不含动物血清，因此不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可能性，而且有效解决了免疫细胞无法存储、长时间运输的问题。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105638642
【申请号】
【发明人】刘军, 唐欢
【申请人】上海润泉生物技术有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月27日