一种免疫细胞冻存液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞冻存领域，特别是免疫细胞冻存领域，尤其涉及一种免疫细胞冻 存液及其应用。
【背景技术】
[0002] 细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已有深入广泛的应用。 对供体的免疫细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对临床还是基础研究均具有重要 意义，尤其是免疫细胞用于回顾性研究时更为重要。冷冻保存免疫细胞不仅可以解决现有 免疫细胞诱导时间较长，需要多次诱导和患者多次采血的问题，还可以把人健康状态最好 或战斗力最强时期的免疫细胞保存下来，用于肿瘤治疗以及抗衰老保健治疗。
[0003] 正常情况下，液体冻结时会造成细胞损伤，其中，一种情况是由于不适当的降温和 复温导致细胞内形成冰晶和重结晶；另一种情况是由于冷冻使得电解质和溶质浓度升高所 导致的溶质损伤。通常，免疫细胞在_70°C~_80°C冻存，细胞活性会随着冷冻时间的延长迅 速下降，在-196Γ时细胞生物学过程几乎停止，因此要长期保存免疫细胞，液氮温度是最佳 的储存温度。选择合适的冷冻保护剂可以避免细胞在冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞 膜和细胞器免受损伤。
[0004] 细胞冻存经常采用渗透性保护剂，例如甘油和二甲基亚砜(DMSO)两种，而甘油作 为冷冻保护剂冻存的免疫细胞存活率较低，但DMSO却可以迅速透入细胞，提高细胞膜对水 的通透性，使水分在细胞冻结前透出细胞外形成冰晶，成为免疫细胞冻存最理想的冷冻保 护剂。
[0005] 目前国内冻存方法多采用的是DMS0、动物血清和细胞培养液按不同比例搭配成的 冻存液，例如CN102301992A公开的用于冻存单个核细胞的冻存液，其包含血浆和二甲基亚 砜，但不仅限于此，还可以包含动物血清和培养基等成分。采用该冻存液的优点是细胞保存 时间长，然而该冻存液中含有的动物血清引入了外源蛋白，同时增加了动物病原污染的可 能性，会对人体过继免疫治疗产生一定影响。目前也有一些采用冻存液中不含动物血清的 文献，例如，CN104026118A公开的免疫细胞冻存液，其包含二甲基亚砜、人供体血浆和免疫 细胞基础培养基。采用该冷冻液的优点在于不会引入外源蛋白，降低了动物病原污染的可 能性，然而该冷冻液冻存细胞的存活率以及细胞活性仍较低。
[0006] 因此，寻找一种如何保持细胞高活性并可实现长期存储、即时复苏的免疫细胞冻 存液及冻存方法是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种免疫细胞冻存液及其应用，特别提供了一种用于免疫 细胞长期保存，并能够在复苏后保持其细胞特性的冻存液及其应用。
[0008] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] 在第一方面，本发明提供了一种免疫细胞冻存液，其包括以下组分：重组人白介 素-2、聚乙二醇、I，2-丙二醇，以及基础培养基或注射用氯化钠。
[0010] 通常，外周血的T细胞、B细胞和NK细胞膜表面均存在白介素-2 (IL-2)受体，IL-2与 其受体结合后可以调节该细胞的增生，调节免疫球蛋白的生成;促进T细胞、B细胞和NK细胞 的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性。然而，目前主要是将IL-2作为体外刺激培养物用 于免疫细胞的扩增培养，而本发明采用将重组人白介素-2(IL-2)添加到免疫细胞冻存液 中，可大幅度提高所述免疫细胞的活性稳定性，使其保持原有细胞高活性，从而使免疫细胞 很好地保持了细胞复苏后的生理功能和生物学特性，可有效解决细胞复苏后直接应用和进 一步扩展的关键问题。
[0011] 本发明在免疫细胞冻存液中添加聚乙二醇和1，2_丙二醇，可以替代现用的二甲基 亚砜(DMSO)为基础的冻存液，有效降低其对细胞毒性，维持细胞稳定性，提高复苏后直接应 用的安全性，适合用于细胞冻存复苏后直接应用。
[0012] 本发明的免疫细胞冻存液并不排除其它成分的存在，比如生理盐水等，然而，本发 明的免疫细胞冻存液不含有DMSO等应用过程存在安全风险的物质。
[0013] 本发明中，所述免疫细胞冻存液包括:重组人白介素-250-200U/mL;聚乙二醇0. Ιο . 4g/mL; 1 ， 2-丙二醇 0 . 2-0 . 4g/mL; 基础培养基或注射用氯化钠 90-99 体积 ％ ，总量为 100%〇
[0014]本发明所述免疫细胞冻存液中的重组人白介素-2的含量为50-200U/mL，例如可以 是50U/mL、60U/mL、80U/mL、IOOU/mL、120U/mL、150U/mL、1600U/mL、180U/mL、200U/mL。
[0015]本发明所述免疫细胞冻存液中的聚乙二醇含量为〇. 1-0.4g/mL，例如可以是0. lg/ mL、0·12g/mL、0·15g/mL、0·2g/mL、0·22g/mL、0·25g/mL、0·3g/mL、0·32g/mL、0·35g/mL、 0·38g/mL、0·4g/mL。
[0016] 本发明所述免疫细胞冻存液中的I，2-丙二醇含量为0.2-0.4g/mL，例如可以是 0·2g/mL、0·22g/mL、0·25g/mL、0·3g/mL、0·32g/mL、0·35g/mL、0·38g/mL、0·4g/mL。
[0017] 本发明所述免疫细胞冻存液中的基础培养基或注射用氯化钠的体积百分含量为 90%、90·5%、91%、91·5%、92%、92·5%、93%、93·5%、94%、94·5%、95%、95·5%、96%、 96.5 %、97 %、97.5 %、98 %、98.5 %、99 %。如果在免疫细胞冻存液中还含有除重组人白介 素-2、聚乙二醇、1，2_丙二醇组分以外的其它组分时，所述基础培养基或注射用氯化钠的含 量会进行适当的下调，比如降低为80%-95%，例如所述基础培养的含量还可以是80%、 80.5%、81%、81.5%、82%、82.5%、83%、83.5%、84%、84.5%、85%、85.5%、86%、 86.5%、87%、87.5%、88%、88.5%、89%、89.5%，以满足所述免疫细胞冻存液中各组分含 量之和为100%。
[0018]本发明所述免疫细胞冻存液中的重组人白介素_2、聚乙二醇、1，2_丙二醇，以及基 础培养基或注射用氯化钠可以采用上述各组分所选择的含量进行任意配合，各组分的体积 百分含量之和为100%。
[0019] 优选地，所述免疫细胞冻存液包括：重组人白介素-280-180U/mL;聚乙二醇0.2_ 0 · 4g/mL; 1，2-丙二醇0 · 25-0 · 4g/mL;基础培养基或注射用氯化钠95-99体积％。
[0020] 本发明所述免疫细胞冻存液中，所述基础培养基为RPMI-1640培养基（THERM0-HyClone)或淋巴细胞培养基[GT551/GT561 (TAKARA)、TBD-DCNK1640(天津灏阳）、X-VIV0?15 (LONZA)]〇
[0021] 优选地，所述淋巴细胞培养基为X-VIVOtmI5(L0NZA)，其均可购自日本LONZA公司。 [0022]本发明所述免疫细胞冻存液中不含有DMS0,因此不会引入外源蛋白，降低了动物 病原污染的可能性，也不会对人体过继免疫治疗产生影响。
[0023]本发明中所述免疫细胞冻存液还含有血清替代物，其适用于采用淋巴细胞培养基 作为基础培养基的情况。例如，所述免疫细胞冻存液还含有Ultroser G(购自PALL)、自体血 浆或胎牛血清中的任意一种。
[0024] 优选地，所述Ultroser G的含量为0 · 2-1 · 8g/mL，例如可以是0 · 2g/mL、0 · 5g/mL、 0·6g/mL、0·8g/mL、Ig/mL、I·2g/mL、I·3g/mL、I·5g/mL、I·6g/mL、I·8g/mL 〇
[0025] 优选地，所述自体血浆的含量为10-90体积％。
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