为每月1-2次， 进一步可减为每1-3月治疗一次。
[0150] 治疗结果总结如表1、2、3所示（B:血清肿瘤标志物减少或消失。Q:病人生活质量 改善。如疼痛减轻或消失，食欲增加等等。C:CT or PET-CT显示癌症病灶或转移病灶明显 减小或消失。），不良反应：未观察到严重不良反应及毒性反应。
[0151] 图12B和图12A显示了 5例经AAV/HPV-16 E7m3感染的DC所诱导的CTL治疗后血 清CK19 (cyfra21-l，正常值〈3. 3ng/ml)和SCC水平（正常值〈5. Ong/ml)的变化情况（纵 坐标表示浓度，ng/mL)。经治疗后，宫颈癌患者的血清角蛋白19抗原（CK19，cyfra21-l，正 常值<3.3ng/mL)和鳞状细胞癌抗原（SSC，正常值<5.0ng/mL)明显下降，甚至恢复正常。
[0152] 图13显示了 2例肛门癌经AAV/HPV-16 E7m21感染的DC所诱导的CTL治疗后血清 CK19(cyfra21-l,正常值〈3. 3ng/ml)的变化情况（纵坐标表示浓度，ng/mL)。肛门癌患者 经AAV/HPV-16 E7-病毒感染的DC所诱导的CTL治疗后血清中CK19抗原水平（cyfra21-l， 正常值<3.3ng/mL)下降，提示治疗有效。
[0153] 图14显示了 4例阴茎癌经AAV/HPV-16 E7m3感染的DC所诱导的CTL治疗后血清 癌胚抗原（CEA,正常值<5.0ng/ml)的变化情况（纵坐标表示浓度，ng/mL)。阴莖癌患者经 AAV/HPV-16 ETnini3病毒感染的DC所诱导的CTL治疗后血清癌胚抗原（CEA，正常值〈5. Ong/ mL)经治疗后血清中CEA水平均下降，提示治疗有效。
[0154] 实验结果表明经治疗后患者的血清角肿瘤标志物（肿瘤相关抗原）均出现明显下 降，甚至恢复正常。临床实验结果进一步证明，被本发明的rAAV感染的DC (统称为rAAV-DC) 所诱导的CTL在患者体内能够发挥一定的疗效，可有效地抑制HPV-16 E7阳性的恶性肿瘤 细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，且安全性较高，可用于制备抗HPV-16感染和抗HPV-16 E7 阳性肿瘤药物。
[0155] 表1用AAV/HPV-16 E7m3病毒-树突状细胞技术（rAAV-DC)
[0156] 治疗宫颈癌患者的疗效的统计结果
[0157] CN 105177048 A 说明书 16/19 页
[0158] 表 2 用 AAV/HPV-16 毒-树突状细胞技术（rAAV-DC)
[0159] 治疗肛门癌患者的疗效的统计结果
[0160] CN 105177048 A 说明书 17/19 页
[0161] 表 3 用 AAV/HPV-16 毒-树突状细胞技术（rAAV-DC)
[0162] 治疗阴茎癌患者的疗效的统计结果
[0163]
[0164] 工业应用件
[0165] 实验证明，被本发明HPV-16 E7?重组腺相关病毒rAAV感染的树突状细胞和所诱 导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地抑制HPV16感染的细胞以及与其相关的恶性 肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞。因而，本发明的HPV-16 E7m重组腺相关病毒载体或与 本发明HPV-16 E7m重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗HPV-16感染的细胞及 其相关的抗肿瘤药物，在临床治疗和应用中具有重要意义。
【主权项】
1. 一种携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)突变型E7m抗原基因的重组腺相关病毒 (rAAV)载体，是将腺相关病毒（AAV)载体中的腺相关病毒结构基因Rep和Cap剔除并带有 AVV的p5启动子、巨噬细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、SV40病毒启动子和beta 肌动蛋白启动子（P-actin)中的任意一个启动子的AVV载体作为出发载体，将多点突变型 HPV-16E7m抗原基因插入出发载体中，获得全新的rAVV载体，即携带HPV-16E7 ""抗原基 因的重组腺相关病毒载体（称"E7?重组腺相关病毒载体"或命名为AAV/HPV-16E7J。2. 根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述多点突变型HPV-16 E7"J)t原基因是将HPV-16E7抗原基因开放读码框ntl75、nt271、nt280的胸腺嘧啶（T)中 的两个或三个替换为鸟嘌呤（G)。3. 根据权利要求1或2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述多点突变型 HPV-16E7"J)t原基因为以下之一： 具有nt175 (58aa)、nt271 (9Iaa)两个突变位点的多点突变型基因，命名为HPV-16E7m21，其核苷酸序列如序列表中序列2或图3A所示； 具有nt175 (58aa)、nt280 (94aa)两个突变位点的多点突变型基因，命名为HPV-16E7m22，其核苷酸序列如序列表中序列3或图3B所示； 具有nt271 (9laa)、nt280 (94aa)两个突变位点的多点突变型基因，命名为HPV-16E7m23，其核苷酸序列如序列表中序列4或图3C所示； 具有ntl75 (58aa)、nt271 (91aa)、nt280 (94aa)三个突变位点的多点突变型基因，命名 为HPV-16ETnini3，其核苷酸序列如序列表中序列5或图3D所示。4. 根据权利要求1-3任一所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：所述腺相关病 毒载体为剔除腺相关病毒（AAV)结构基因Rep和Cap的腺相关病毒载体，其携带的启动 子为p5启动子、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、人beta肌动蛋白启动子 (0 -actin)或SV40病毒早期启动子中的任意一个。5. -种构建权利要求1-4任一所述重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤： 1) 将HPV-16E7抗原的第58、91和94位的半胱氨酸（G)中两个或三个改变为甘氨酸 (0,即将HPV-16E7基因开放读码框ntl75、nt271、nt280中的两个或三个胸腺嘧啶（T)替 换为鸟嘌呤（G)，得到具有两个或三个突变位点的多点突变型HPV-16E7抗原基因，统一命 名为HPV-16E7?; 2) 分别将多点突变型HPV-16E7?抗原基因或野生型HPV-16E7抗原基因插入已将腺 相关病毒结构基因Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，分别得到携带多点突变型HPV-16 E7m抗原基因的重组腺相关病毒载体（AAV/HPV-16E7J或携带HPV-16E7抗原基因的重 组腺相关病毒载体（AAV/HPV-16E7);所述腺相关病毒载体携带的启动子为p5启动子、巨 细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、人beta肌动蛋白启动子（0-actin)或SV40 病毒早期启动子中的任意一个。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)具体过程如以下任一所述： 一、将E7抗原蛋白的第58和91位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程为将HPV-16E7基因开放读码框ntl75和nt271两个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码 半胱氨酸的tgc(ntl75-177和nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，得到具有两个突变位 点的HPV-16E7抗原基因，命名为HPV-16ETnini21;得到的携带两点突变型HPV-16E7m21抗原 基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16ETnini21; 二、将E7抗原蛋白的第58和94位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程为将 HPV-16E7基因开放读码框ntl75和nt280两个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码 半胱氨酸的tgc(ntl75-177)和tgt(nt280-282)分别改变为编码甘氨酸的ggc和ggt，得 到具有两个突变位点的HPV-16E7抗原基因，命名为HPV-16ETnini22;得到的携带两点突变型 HPV-16E7m22抗原基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16ETnini22; 三、 将E7抗原蛋白的第91和94位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程为将 HPV-16E7基因开放读码框nt271和nt280两个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码 半胱氨酸的tgc(nt271-273)和tgt(nt280-282)分别改变为编码甘氨酸的ggc和ggt，得 到具有两个突变位点的HPV-16E7抗原基因，命名为HPV-16ETnini23;得到的携带两点突变型 HPV-16E7m23抗原基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16ETnini23; 四、 将E7抗原蛋白的第58、91和94位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程为将 HPV-16E7基因开放读码框ntl75、271和280三个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编 码半胱氨酸的tgc(ntl75-177和nt271-273)和tgt(nt280-282)分别改变为编码甘氨酸的 ggc和ggt，得到具有三个突变位点的HPV-16E7抗原基因，命名为HPV-16E7m3;得到的携 带三点突变型HPV-16 基因的重组腺相关病毒载体命名为AAV/HPV-16E7m3。7. 与权利要求1-4任一所述重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16ETni91和重组腺相关病毒 载体AAV/HPV-16E7相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被所述 重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，细胞系包括单核细胞（Monocyte，Mo)和树突状 细胞（DendriticCells，DC) 〇8. 制备权利要求7所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16E7和AAV/HPV-16E7 "相 关产品的方法，分别为： 重组腺相关病毒载体质粒的制备：将重组腺相关病毒载体DNA-AAV/HPV-16E7或AAV/HPV-16E7"J>别导入基因工程大肠杆菌（E.coli)DH5a感受态细胞，用含lOOyg/mL 氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/HPV-16 E7 质粒和AAV/HPV-16E7m质粒； 重组腺相关病毒的制备：以所述重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16E7质粒或AAV/HPV-16E7"JPpHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到AAV病毒，分别命名为AAV/HPV-16 E7 病毒和AAV/HPV-16E7m病毒； 重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述重组腺相关病毒AAV/HPV-16E7病毒或AAV/HPV-16E7J^毒分别或依次感染或转染单核细胞（Mo)、树突状细胞（DC)或 淋巴细胞得到。9. 一种抗HPV-16感染以及由HPV-16感染导致的恶性肿瘤的细胞免疫治疗药物，其活 性成分为权利要求1-4之一所述或权利要求5或6方法制备得到的携带HPV-16E7"91抗原 基因的重组腺相关病毒载体（AAV/HPV-16E7J，或权利要求7所述或权利要求8方法制备 得到的与携带HPV-16E7"Jt原基因的重组腺相关病毒载体相关的产品，包括AAV/HPV-16 E7m质粒、AAV/HPV-16E7 ^病毒、被HPV-16E7 ""重组腺相关病毒分别或依次感染或转染得 到的单核细胞（Mo)或树突状细胞（DC)。10. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述由HPV-16感染导致的恶性肿瘤为 HPV-16E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、宫颈癌、男性生殖器Bowen's病、巨大尖锐湿疣、阴 茎癌、肛门癌、直肠癌、□腔癌、扁桃体癌以及乳腺癌等。11. 一种杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞的方法，包括以下步 骤： 1) 将患者体内自然产生的单核细胞被权利要求1-4任一所述携带HPV-16 因的重组腺相关病毒载体（AAV/HPV-16E7J感染或转染，或被权利要求6所述与本发明重 组腺相关病毒载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞； 2) 将步骤1)中处理后的单核细胞（Mo)诱导的树突状细胞（DC)输入患者体内中，激活 细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，该CTL杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞； 或将未被处理的T淋巴细胞与所述处理后的Mo-DC混合培养形成HPV-16E7抗原特异性的 CTL，再将该CTL输入患者体内杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16E7阳性的肿瘤细胞；或将 被处理的T淋巴细胞和被处理的Mo-DC输入患者体内中，杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞。
【专利摘要】本发明携带HPV-16？E7mm抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法，是将具有致瘤性的HPV-16的E7抗原基因多点突变为无致瘤性的E7抗原基因，再将该突变后基因插入已经剔除结构基因的腺相关病毒载体中而获得的。该重组腺相关病毒可将其携带的突变型HPV-16？E7mm抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞。实验证明，被该组腺相关病毒感染的DC所诱导的CTL在体外和患者体内均可有效地抑制HPV-16？E7阳性细胞的生长或者杀灭HPV-16？E7阳性的细胞，且无致瘤性。本发明的重组腺相关病毒载体或其相关产品可被用于制备治疗HPV-16感染及其相关的抗肿瘤药物。
【IPC分类】C12N5/10, A61K39/12, C12N15/864, A61K48/00, A61P35/00, C12N7/01, A61P31/20
【公开号】CN105177048
【申请号】
【发明人】刘勇, 陈巧林, 曾昭鹏, 高洪吉, 龚研浩, 董文娟, 张慧
【申请人】广东拓谱康生物科技有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月12日