Colony-Stimulating Factor Gene into Monocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus. Journal of Interferon and Cytokine Research. 20:21 - 30. 2000)。
[0094] D.脂质体转染试剂Lipofectin :购自美国Life Technology公司。
[0095] Ε· DMEM培养基和胎牛血清（或小牛血清）：购自美国Cellgro公司。
[0096] F. PCR DIG标记试剂盒和DIG杂交检测试剂盒：购自瑞士 Roche公司。
[0097] G. DNA拷贝数标准：分别为IO12拷贝数（copies)/μ L至IO6(Copies)/μ L，购自美 国Promega公司。
[0098] 一、重组腺相关病毒（rAAV)的制备
[0099] 图5显示携带HPV-16 E7?突变基因的重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7 J以及 携带HPV-E7基因的重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7)的制备方法流程图。如图5所示， 用下述方法制备重组腺相关病毒（rAAV)，以制备一盘10.0 cm细胞培养皿的病毒为例，当 AAV-HEK293细胞在二氧化碳细胞培养箱中生长至约占培养皿面积70%时，进行如下操作：
[0100] A.按照Lipofectin的使用说明进行操作：将1.0 yg rAAV、LOyg pHelper质粒、 4. 0 μ L Lipofectin和50. 0 μ L含5%胎牛血清（或小牛血清）的DMEM培养基混匀，室温 静置20分钟。
[0101] Β.将混合液加入细胞培养皿中，继续置于二氧化碳细胞培养箱中培养。
[0102] C. 72小时后，收获培养皿中的所有细胞和培养液。
[0103] D.剧烈振荡1分钟后，离心，保留上清，即rAAV病毒液。
[0104] E.将收集的rAAV病毒液过滤除菌。
[0105] 二、重组腺相关病毒（rAAV)的病毒滴度测定
[0106] 采用常规的斑点杂交法，对步骤一获得的rAAV病毒进行病毒滴度测定，具体方法 包括以下步骤：
[0107] A.采用常规的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒颗粒DNA。
[0108] B.将尼龙膜置于斑点印迹仪中，加入经碱变性的rAAV病毒颗粒DNA，并加入DNA 拷贝数标准，抽真空。
[0109] C.取出尼龙膜干燥后，紫外线固定。
[0110] D.用PCR DIG标记试剂盒并参照试剂盒说明书制备DIG标记的特异性探针，所用 的DNA探针为针对HPV-16 E7基因的特异性探针，为实施例1步骤C中获得的HPV16-E7 DNA。PCR扩增结束后，对PCR扩增产物进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外线下检测PCR扩 增产物，结果出现阳性条带，表明探针标记成功。
[0111] E.用DIG杂交检测试剂盒并参照试剂盒说明书，在杂交炉中对各种rAAV病毒颗粒 DNA进行DNA杂交。
[0112] 实验结果所有rAAV病毒（四种AAV/HPV-16 E7m病毒和一种AAV/HPV-16 E7病 毒）滴度为IOll-IO14拷贝/mL，表明获得的rAAV的病毒滴度较高，完全可以用于研究和临 床实践。
[0113] 实施例3、重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7m病毒和AAV/HPV-16 E7病毒感染原代 宫颈上皮细胞的致瘤性观察
[0114] 材料及其来源：
[0115] A. rAAV病毒：实施例2获得的重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7?病毒和AAV/ HPV-16 E7 病毒）。
[0116] B. Keratinocyte-SCF 细胞培养基：购自美国 Life Technology 公司。
[0117] C.原代宫颈上皮细胞：由用常规方法从正常的宫颈上皮组织中分离获得。
[0118] 致瘤性观察实验
[0119] 将原代宫颈上皮细胞在放入10.0 cm细胞培养皿中，立即加入 IOmLKeratinocyte-SCF细胞培养基，置二氧化碳培养箱中在37°C下培养。待细胞完全贴 壁后，取出培养皿，将去除7mL培养液后，按照100M0I剂量分别加入重组腺相关病毒AAV/ HPV-16 E7m病毒或AAV/HPV-16 E7病毒，重置于二氧化碳培养箱。8小时后，取出培养皿， 去除培养液，加入IOmL新鲜的Keratinocyte-SCF细胞培养基，重置于二氧化碳培养箱中在 37°C下培养。每2天更换培养基。每天定时观察细胞形态变化2次。直至细胞出现瘤变。
[0120] 图6示出了四种重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7?(均以携带CMV启动子的rAAV 为代表）和AAV/HPV-16 E7感染原代宫颈上皮细胞的致瘤性观察结果。实验结果显示，被 AAV/HPV-16 E7m病毒感染的细胞仍保持细胞正常状态，未发生瘤变，表明无致瘤性，而被 AAV/HPV-16 E7病毒感染的细胞发生明显瘤变，具有致瘤性。结果表明该rAAV均在细胞中 表达，但HPV-16 E7抗原蛋白导致细胞瘤变，而HPV-16 E7?抗原蛋白不导致细胞瘤变。
[0121] 实施例4、肿瘤抗原导入单个核细胞-树突状细胞系的杀灭肿瘤实验
[0122] 材料及其来源：
[0123] A. rAAV病毒：实施例2方法制备得到的AAV/HPV-16 E7nlnl病毒和 AAV/HPV-16 E7 病毒。
[0124] A頂-V细胞培养基：购自美国Life Technology公司。
[0125] C.细胞因子：集落细胞刺激因子（GM-CSF)和白细胞介素2、4、7购自美国R&D公 司。
[0126] D.HPV-16 E7阳性的细胞：从肿瘤组织中分离获得或从美国组织细胞保存中心 (ATCC)获得，恶性肿瘤包括宫颈癌细胞、乳腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细 胞。
[0127] E. HPV-16 E7阴性的细胞：从人的正常组织中分离获得或从美国组织细胞保存中 心（ATCC)获得，包括肺、乳腺、肝脏和肾脏上皮细胞。
[0128] 一、杀灭肿瘤实验
[0129] 图7显示AAV/HPV-16 E7Jg染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭HPV-16 E7抗原 阳性细胞的实验流程。如图7所示，将本发明的携带HPV-16 E7或HPV-16 E7?抗原基因 的rAAV病毒（AAV/HPV-16 E7病毒或AAV/HPV-16 E7nlnl病毒）感染患者单核细胞为基础的 杀灭HPV-16 E7抗原阳性的细胞实验的整个过程包括以下步骤：
[0130] A.取肿瘤患者50_150mL外周血，用血细胞分离仪（或淋巴细胞分离液）按常规方 法获取外周血单个核细胞（PBMC)，与A頂-V培养基混匀后，加入细胞培养瓶，置于恒温二氧 化碳培养箱中在37°C下培养2小时。
[0131] B.除去悬浮细胞，保留贴壁细胞（单核细胞）。悬浮细胞即外周血淋巴细胞，将其 与AM-V培养基混匀后，继续培养备用。
[0132] C.加入rAAV病毒，加入量约为100M0I，同时再加入GM-CSF(600IU/mL)，继续培养 4小时。
[0133] D.除去旧培养基，补充含GM-CSF和IL-4(600IU/mL)的A頂-V培养基，继续培养。
[0134] E.培养5天后，收获成熟的树突状细胞（DC)，并与所培养的外周血淋巴细胞混合， 在A頂-V培养基中加入IL-2 (lOIU/mL)以及IL-7 (200IU/mL)，继续培养。
[0135] F.培养至7-9天后，收获激活的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)进行检测。
[0136] 二、树突状细胞（DC)和细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的检测
[0137] A. rAAV感染外周血单个核细胞的效率检测
[0138] 采用常规的荧光抗体标记染色法，用针对HPV-16 E7特异性荧光抗体（购自美国 BD公司）标记步骤一获得的被本发明rAAV感染的单个核细胞（PBMC)或未成熟的树突状细 胞（DC)，再进行流式细胞仪检测阳性细胞的数量。其中，rAAV感染单核细胞（Mo)的效率检 测结果如图8所示，四种多突变型AAV/HPV-16 E7nlnl病毒（分别以携带CMVp启动子、SV40病 毒早期启动子SV40p、AAV p5启动子以及人beta肌动蛋白启动子β-actin启动子的rAW 为代表）感染外周血单核细胞的效率均约为90%，即约百分之九十的外周血单核细胞可被 rAAV病毒感染，证明本发明的rAAV具有较高的感染效率。
[0139] B.树突状细胞（DC)的⑶分子水平的检测
[0140] DC表达⑶80和⑶86的水平与DC的功能呈正相关。用与步骤A相同的检测方法， 即分别采用荧光标记的针对这二种CD分子的抗体（购自美国BD公司）对步骤一获得的DC 表达CD80和CD86的水平进行检测。AAV/HPV-16 ETniJf毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的 DC表达CD80和CD86水平的检测结果如图9所示（以带CMV启动子的rAAV为代表均可获 得高水平表达的⑶80和⑶86,提示DC的功能较强），表明被感染的DC所表达的⑶分子水 平较高，证明本发明携带HPV-16 E7或HPV-16 E7?抗原基因的rAAV感染的单核细胞所诱 导的DC的激发细胞免疫反应的功能强大。
[0141] C.细胞毒性T淋巴细胞（CTL)表达的γ干扰素（IFN-γ)水平的检测
[0142] CTL的功能及其杀伤肿瘤细胞的能力与IFN-γ的表达水平呈正相关。用与步骤A 类似的方法检测被本发明rAAV感染的DC所诱导的CTL表达IFN- γ的水平。DC与外周血 淋巴细胞混合培养结束后，收获细胞，采用传统的胞内染色法进行细胞荧光染色标记，所用 抗体为针对IFN-γ的荧光标记抗体（购自美国BD公司），最后利用流式细胞仪检测结果。 其中，被AAV/HPV-16 Ε7-病毒或AAV/HPV-16 Ε7病毒感染的DC所诱导的CTL的IFN-γ表 达水平如图10所示（以带CMV启动子的rAAV为代表），被携带CMV启动子的AAV/HPV-16 E7m3病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL表达高水平的IFN- γ。表明被本 发明AAV/HPV-16 E7mS AAV/HPV-16 Ε7感染的DC所诱导的CTL杀伤靶细胞的活性较强 (功能强大）。
[0143] 上述B和C实验结果亦证明AAV/HPV-16 E7m与携带野生型E7抗原基因的rAAV/ HPV-16 E7的功能相当，能够发动有效的细胞免疫反应，即不仅能够有效刺激DC功能，而且 也能够导致CTL的产生。
[0144] D.细胞毒性T淋巴细胞（CTL)杀伤肿瘤细胞试验
[0145] 混合培养结束后，将步骤一中被AAV/HPV-16 E7m病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染 的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞按20:1(淋巴细胞：肿瘤细胞）分别与宫颈癌细胞、乳 腺癌细胞、阴茎癌细胞、肛门癌细胞和口腔癌细胞混合后，采用传统的51Cr (铬-51)杀伤试 验，检测CTL杀伤肿瘤细胞的活性。其中肿瘤细胞杀伤率统计结果如图11A-11D(以带CMV 启动子的AAV/HPV-16 E7J^毒为例，纵坐标表示杀伤率）所示，被本发明AAV/HPV-16 E7m病毒或AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL能够更有效地裂解（杀伤）HPV-16感 染的上皮细胞和HPV-16 E7阳性的癌细胞，杀伤率为40% -70%左右。
[0146] 以 HPV-16 E7 阴性的肺（lung)、乳腺（breast)、肝（liver)、肾（k-cells)的细 胞为对照，再用上述相同的方法检测步骤一中被AAV/HPV-16 E7J^毒或AAV/HPV-16 E7 病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的特异性。其中，被rAAV感染 的DC所诱导的CTL的肿瘤细胞杀伤特异性检测结果同样见图11A-11D(以带CMV启动子 的AAV/HPV-16 E7m病毒为例，纵坐标表示杀伤率）所示，被本发明AAV/HPV-16E7J^毒或 rAAV/HPV-16 E7病毒感染的DC所诱导的CTL对肺（lung)、乳腺（breast)、肝（liver)及肾 (k-cells)细胞无杀伤作用，证明被本发明AAV/HPV-16 E7"JigAAV/HPV-16 E7病毒感染的 DC所诱导的CTL具有抗原特异性，即对抗原阴性的细胞无杀伤作用。
[0147] 上述检测结果表明，被本发明携带突变型HPV-16 E7m抗原基因的重组腺相关病毒 (AAV/HPV-16 E7nlnl病毒）感染的DC(统称为rAAV-DC)所诱导的CTL对HPV-16 E7阳性的 细胞具有强大的杀伤（裂解）效果，具有较好的疗效，与野生型HPV-16 E7抗原诱导的CTL 的杀伤功能无区别，而且无致瘤性，可用于制备抗肿瘤药物。
[0148] 实施例5、HPV-16 E7抗原阳性的肿瘤治疗的临床实验
[0149] 应用重组腺相关病毒-树突状细胞技术，即实施例4中被本发明的AAV/HPV-16 E7 病毒或AAV/HPV-16 ETnini3病毒感染的DC所诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)回输5例宫颈 癌、2例肛门癌和4例阴茎癌患者。所有患者已经被证实其癌组织为HPV-16 E7阳性。输注 量为2X10S-5X108。治疗疗程：通常为6个月，每月2次，病情改善后可减