Tnini21;
[0022] 二、将E7抗原蛋白的第58和94位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程为将 HPV-16 E7基因开放读码框ntl75和nt280两个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码 第58位半胱氨酸的tgc (ntl75-177)改变为编码甘氨酸的ggc，将编码第94位半胱氨酸的 tgt (nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因， 命名为HPV-16 ETnini22，再分别将多点突变型HPV-16 E7m22抗原基因插入已经将腺相关病毒 结构基因 Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多点突变型HPV-16 E7m22抗原基 因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 ETnini22;
[0023] 三、将E7抗原蛋白的第91和94位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程为将 HPV-16 E7基因开放读码框nt271和nt280两个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码 第91位半胱氨酸的tgc (nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，将编码第94位半胱氨酸的 tgt (nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到具有两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因， 命名为HPV-16 ETnini23，再分别将多点突变型HPV-16 E7m23抗原基因插入已经将腺相关病毒 结构基因 Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多点突变型HPV-16 E7m23抗原基 因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 ETnini23;
[0024] 四、将E7抗原蛋白的第58、91和94位半胱氨酸（G)改变为甘氨酸（C)，详细过程 为将HPV-16 E7基因开放读码框ntl75、nt271和nt280三个胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤 (G)，即将编码第58、91位半胱氨酸的tgc (ntl75-177和nt271-273)改变为编码甘氨酸的 ggc，将编码第94位半胱氨酸的tgt (nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到具有三个突 变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 E7-，再分别将多点突变型HPV-16 ETnilJit 原基因插入已经将腺相关病毒结构基因 Rep和Cap剔除的腺相关病毒载体中，得到携带多 点突变型HPV-16 基因的重组腺相关病毒载体，命名为AAV/HPV-16 E7m3。
[0025] 本发明还一目的是提供与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7?和重组腺相关病 毒载体AAV/HPV-16 E7相关的产品，包括重组腺相关病毒质粒、重组腺相关病毒颗粒和被 本发明重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系，所述细胞系包括单核细胞（Monocytes， Mo)和树突状细胞系（Dendritic cells，DC)。所述重组腺相关病毒载体中的相关基因一 HPV-16 E7m抗原基因或HPV-16 E7抗原基因可在单核细胞或树突状细胞中在上述转录启 动子的作用下获得表达。
[0026] 所述与重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7?相关的产品的制 备方法，分别为：
[0027] 重组腺相关病毒载体质粒的制备：将重组腺相关病毒载体DNA - AAV/HPV-16 E7 或AAV/HPV-16 E7?分别导入基因工程大肠杆菌（E. coli)DH5a感受态细胞，用含IOOyg/ mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到AAV/ HPV-16 E7 质粒和 AAV/HPV-16 E7m质粒。
[0028] 重组腺相关病毒的制备：以所述重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16 E7质粒或 AAV/HPV-16 E7"^P pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞得到AAV病毒，分别命名为AAV/ HPV-16 E7 病毒和 AAV/HPV-16 E7m病毒。
[0029] 重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述重组腺相关病毒AAV/ HPV-16 E7病毒或AAV/HPV-16 E7J^毒分别或依次感染或转染单核细胞（Mo)、树突状细胞 (DC)或淋巴细胞得到。
[0030] 实际用途方面，本发明的另一个目的是提供一种抗HPV-16感染以及由HPV-16感 染导致的恶性肿瘤的细胞免疫治疗的药物及其相关技术。
[0031] 所述药物的活性成分为上述携带HPV-16 E7?抗原基因的重组腺相关病毒载体 (AAV/HPV-16 E7 J或与本发明携带HPV-16 E7?抗原基因的重组腺相关病毒载体相关的产 品（由于野生型HPV-16 E7抗原存在致瘤性，故不考虑其药用）。
[0032] 以本发明的E7m重组腺相关病毒为载体，将HPV-16突变型E7 m抗原基因导入单核 细胞，并诱导产生树突状细胞，亦可直接导入树突状细胞，表达ETraJt原蛋白，以达到患者 体外和体内免疫刺激的目的，用以治疗HPV-16感染以及相关恶性肿瘤，或以该树突状细胞 刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTL)治疗HPV-16感染以及 相关恶性肿瘤。
[0033] 所述由HPV-16感染导致的恶性肿瘤包括HPV-16 E7抗原阳性的宫颈乳头瘤病变、 宫颈癌、男性生殖器Bowen' s病、巨大尖锐湿疣、阴茎癌、肛门癌、直肠癌、口腔癌、扁桃体癌 以及乳腺癌等。
[0034] 本发明所提供的药物可采用溶剂或粉剂等剂型。
[0035] 所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液（基）、生理盐水或磷酸盐缓冲液等 均可。
[0036] 需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
[0037]用药方式可为先分离出患者体内的单核细胞（Mo)，再将此药感染或转染Mo后，体 外诱导Mo成为具有抗原提呈功能的树突状细胞（DC)。此药亦可感染或转染DC，但有可能 导致DC对抗原的摄取或加工能力较差，从而导致疗效不佳。所获得的DC可回输患者体内， 达到治疗目的。或将表达HPV-16突变型E7?抗原的成熟的DC所刺激产生的细胞毒性T淋 巴细胞（CTL)回输患者，以取得更佳的疗效。
[0038] 上述药物的用量一般为DC :1-5X106/每次，CTL:1-5X108/每次，每月2次，疗程 通常为3个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
[0039] 为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂、靶向和化疗药物等进行 组合治疗。
[0040] 本发明还提供了一种杀灭HPV-16感染细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞的方法。
[0041] 该方法可包括以下步骤：
[0042] 1)将从患者体内分离的单核细胞（Mo)，或分离出的Mo被诱导成为的树突状细胞 (DC)，被携带HPV-16 E7?抗原基因的重组腺相关病毒载体（AAV/HPV-16 E7J感染或转染， 或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理，各自得到处理后的细胞；
[0043] 2)将步骤1)中处理后的DC输入患者体内中，以激活患者体内的免疫反应，达到杀 灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞的目的；或将未被处理的T淋巴细胞与 所述处理后的DC混合培养，刺激产生HPV-16 E7抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)， 再将该抗原特异性CTL输入患者体内，杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细 胞；或将被处理的CTL和被处理的DC输入患者体内中，杀灭HPV-16感染的细胞和HPV-16 E7阳性的肿瘤细胞。
[0044] 所述杀灭恶性肿瘤的方法可具体应用到临床治疗中，包括给予一个患者回输 HPV-16 E7抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，该细胞由来源于患者自然产生的T淋巴细胞与 来源于该患者的单核细胞-树突状细胞混合培养产生的。在混合培养之前，这些在单核细 胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16 E7?抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者 转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；
[0045] 或者，给予一个肿瘤患者回输来源于患者的单核细胞-树突状细胞。在回输之前， 这些在单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16 E7?抗原基因的重组腺相关病毒 载体感染或者转染，或被与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品处理；
[0046] 再或者，给予一个恶性肿瘤患者回输上述来源于患者的T淋巴细胞和来源于该患 者的自然产生的单核细胞-树突状细胞。在回输之前，这些T淋巴细胞已经被本发明携带 HPV-16 E7m抗原基因的重组腺相关病毒载体感染或者转染的单核细胞-树突状细胞相关 的产品处理。这些单核细胞-树突状细胞已经被本发明携带HPV-16 E7?抗原基因的重组 腺相关病毒载体感染或者转染。
[0047] 本发明的重组腺相关病毒（rAAV)载体可将其携带的HPV-16 E7?抗原基因输送入 单核细胞-树突状细胞系中，携带带有HPV-16 E7?抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的 效应细胞（不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞）。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突 状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在患者体内可有效地杀灭HPV-16E7抗原阳性的肿 瘤细胞或HPV-16感染的细胞，而且无致病性（即无致瘤性）。因而，本发明的rAAV载体或 与本发明rAAV载体相关的产品可被用于制备抗肿瘤药物。本发明在肿瘤的临床治疗和应 用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
[0048] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【附图说明】
[0049] 图1携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或突变型E7m基因的重组腺相关病 毒载体的结构示意图。
[0050] 图2通过多聚酶链反应（PCR)从宫颈癌组织中获得长度为297bp的HPV-16 E7DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
[0051] 图3A-图3D四种多点突变型HPV-16 E7?基因序列与HPV-16 E7基因序列比对结 果。
[0052] 图4构建的AAV/HPV-16 E7?载体的酶切分析结果。
[0053] 图5重组腺相关病毒rAAV的制备方法流程图。
[0054] 图6四种重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7m病毒）和AAV/HPV-16 E7病毒感染原 代宫颈上皮细胞的致瘤性观察结果。
[0055] 图7 AAV/HPV-16 E7J^毒感染肿瘤患者单核细胞为基础的杀灭HPV-16 E7抗原 阳性细胞的实验流程。
[0056] 图8四种重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7m病毒）感染外周血单个核细胞的效率 检测结果。
[0057] 图9重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7-病毒和AAV/HPV-16 E7病毒感染的DC表 达⑶80和⑶86水平的流式细胞技术检测结果。
[0058] 图10重组腺相关病毒AAV/HPV-16 E7-病毒和AAV/HPV-16 E7病毒分别感染的 DC所诱导的CTL的IFN-γ表达水平的流式细胞技术检测结果。
[0059] 图IlA AAV/HPV-16 E7m21感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 Ε7阳性细胞 和阴性细胞的51Cr (铬-51)杀伤实验结果。
[0060] 图IlB AAV/HPV-16 E7m22感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞 和阴性细胞的51Cr (铬-51)杀伤实验结果。
[0061] 图lie AAV/HPV-16 E7m23感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞 和阴性细胞的51Cr (铬-51)杀伤实验结果。
[0062] 图IlD AAV/HPV-16 E7-感染的DC所诱导的CTL体外杀伤HPV-16 E7阳性细胞 和阴性细胞的51Cr (铬-51)杀伤实验结果。
[0063] 图12A 5例宫颈癌患者经重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7m3病毒）感染的DC所 诱导的CTL治疗后血清鳞状细胞癌抗原（SCC)水平的变化情况。
[0064] 图12B 5例宫颈癌患者经重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7m3病毒）感染的DC所 诱导的CTL治疗后血清角质蛋白19抗原（CK19)水平的变化情况。
[0065] 图13 2例肛门癌患者经重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7-病毒）感染的DC所 诱导的CTL治疗后血清角质蛋白19抗原（CK19)水平的变化情况。
[0066] 图14 4例阴茎癌患者经重组腺相关病毒（AAV/HPV-16 E7-病毒）感染的DC所 诱导的CTL治疗后血清癌胚抗原（CEA)水平的变化情况。
【具体实施方式】
[0067] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook,J. ,Russell,David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0068] 所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量（W/W，单位g/lOOg)百分比浓度、 质量/体积（W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积（V/V，单位mL/100mL)百分比浓 度。
[0069] 所用引物合成及DNA序列测定均由美国Life Technology公司完成