。
[0070] 实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达 到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的 来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提 示替换使用。
[0071] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的 操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0072] 实施例1、构建重组腺相关病毒载体AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7m
[0073] 一、材料及其来源：
[0074] A.四种腺相关病毒（AAV)载体：即分别为具有AAV p5启动子的pAAV/p5、具有巨 噬细胞病毒（CMV)启动子的pAAV/CMVp、具有SV40病毒早期启动子的pAAV/SV40p和具有 人β-肌动蛋白（β-actin)启动子的ρΑΑν/β-actinp。已知的腺相关病毒载体具有p5 启动子，为提高目的基因的转录水平，可将重组腺相关病毒载体中的P5启动子替换为巨噬 细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的 一个，该四种AAV载体仅启动子不同，其余的基因结构完全相同，即具有AAV 2型两端完整 的重复末端片段（TR)序列，并在两端TR的第75位核苷酸序列处均插入有9个核苷酸片段 (CTGCGCTGG，目的是提高重组AAV病毒（rAAV)的稳定性以及提高病毒的复制效率）、且无任 何AAV结构基因（Rep和Cap)。该四种AAV载体由本专利申请的发明人成功构建（构建方 法参见中国专利ZL201110125683. X)。
[0075] B.人宫颈癌组织：实验所用来源于手术切除的宫颈癌癌组织，免疫组化证实 HPV-16抗原阳性。
[0076] C.基因扩增核苷酸引物：根据美国基因库中公开发表的HPV-16 E7基因序 列（美国NCI基因库：KC935953)设计，上游引物：5' -ATGCATGGAGATACA-3'，下游引物： 5' -TTATTGTTTCTGAGAA-3'。
[0077] 二、构建携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或突变型E7?基因的重组腺相关 病毒载体
[0078] 用下述方法分别构建本发明携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或突变型E7m基因的重组腺相关病毒载体，其结构示意图如图1 (图中"插入的外源性基因"分别为人乳 头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或四种具有二个或三个点突变的HPV-16 E7?抗原基因，启 动子分别为AAV的p5启动子、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV)启动子、beta肌动蛋 白启动子和SV40病毒早期启动子中的任意一个）所示，具体过程包括以下步骤：
[0079] A.获取 HPV-16 E7 DNA，具体方法为：采用 DNAzol 试剂（美国 Life Technology 公司生产）并按说明书进行操作：首先将HPV-16 E7抗原阳性的宫颈癌组织反复碾磨后， 加入IOmL DNAzol，离心获取上清液后，用75%乙醇洗涤2次，再加入无水乙醇，离心，将沉 淀物用去离子水溶解，将DNA浓度调至IOOng/ μ L。以2 μ L DNA溶液为模板，在上游引物 5' -ATGCATGGAGATACA-3' 和下游引物 5' -TTATTGTTTCTGAGAA-3' 的引导下 PCR 扩增 HPV-16 E7 DNA。PCR扩增条件为：先94°C 4分钟；再94°C 30秒，60°C 35秒，72°C 50秒，共30个 循环；最后72°C 8分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检 测结果如图2所示，出现一条长度为297bp与预期结果一致的特异性条带，将该目的条带回 收并纯化后得到长度为297bp HPV-16E7。进行DNA序列测定，其核苷酸序列如序列表中序 列1所示，进一步证明PCR扩增的HPV-16 E7基因序列正确。
[0080] B.获取具有两个点突变的HPV-16 E7? DNA，具体方法为：为获取具有两个点突变 的E7?基因，均采用基因点突变试剂盒（美国Strategeng公司），按照其试剂盒说明书进 行操作，共获取三个具有两个点突变的HPV-16 E7? DNA:
[0081] (1)HPV-16 E7m21 :先将 HPV-16 E7 基因（美国 NCI 基因库：KC935953)开放读 码框ntl75胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgc(ntl75-177)改变 为编码甘氨酸的ggc，再将HPV-16 E7基因开放读码框nt271位胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌 呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt271-273)改变为编码甘氨酸的ggc，得到第一个具有 两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 ETnini21。完成后，进行DNA序列测定， 基因序列如序列表中序列2所示，HPV-16 E7m21基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对 结果如图3A所示（图中斜体部分nt736、832为突变），图中显示野生型HPV-16 E7序列 nt736-nt738, nt832-nt834的核苷酸序列均为TGC，编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 ETnini2I 基因经DNA测序，结果表明该二个三联密码子均改变为GGC，编码甘氨酸，证明基因突变成 功。
[0082] (2)HPV-16 E7m22:先将 HPV-16 E7 基因（美国 NCI 基因库：KC935953)开放读 码框ntl75胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgc(ntl75-177)改变 为编码甘氨酸的ggc，再将HPV-16 E7基因开放读码框nt280胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌 呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到第二个具有 两个突变位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 ETnini22。完成后，进行DNA序列测定， 基因序列如序列表中序列3所示，HPV-16 E7m22基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对 结果如图3B所示（图中斜体部分nt736、841为突变），图中显示野生型HPV-16 E7序列 nt736-nt738, nt841-nt843的核苷酸序列分别为TGC和TGT，均编码半胱氨酸，而获得的 HPV-16 ETnini22基因经DNA测序，结果表明该二个三联密码子分别改变为GGC和GGT，编码甘 氨酸，证明基因突变成功。
[0083] (3)HPV-16 E7m23:先将 HPV-16 E7 基因（美国 NCI 基因库：KC935953)开放读码框 nt271位胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)，即将编码半胱氨酸的tgc(nt271-273)改变为编 码甘氨酸的ggc，再将HPV-16 E7基因开放读码框nt280位胸腺嘧啶（T)替换为鸟嘌呤（G)， 即将编码半胱氨酸的tgt(nt280-282)改变为编码甘氨酸的ggt，得到第三个具有两个突变 位点的HPV-16 E7抗原基因，命名为HPV-16 ETnini23。完成后，进行DNA序列测定，基因序列 如序列表中序列4所示，HPV-16 ETnini23基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3C 所示（图中斜体部分nt832、841为突变），图中显示野生型HPV-16 E7序列nt832-nt834， nt841-nt843的核苷酸序列分别为TGC和TGT，编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 ETnini23基因 经DNA测序，结果表明该二个三联密码子分别改变为为GGC和GGT，编码甘氨酸，证明基因突 变成功。
[0084] C.获取三个点突变的HPV-16 ETnini3DNA,具体方法为：以上述获得的具有两个点突 变的HPV-16 E7m21DNA作为模板，再将该DNA的核苷酸序列nt280位的胸腺嘧啶（T)替换 为鸟嘌呤（G)，即将tgt(nt280-282)改变为ggt，得到具有三个突变位点的HPV-16E7抗 原基因，命名为HPV-16 完成后，进行DNA序列测定，基因序列如序列表中序列5所 示，HPV-16 ETnini3基因序列与HPV-16 E7基因序列的比对结果如图3D所示（图中斜体部 分 nt736、832、841 为突变），图中显示野生型 HPV-16 E7 序列 nt736-nt738, nt832-nt834， nt841-nt843核苷酸序列分别为TGC，TGC和TGT，均编码半胱氨酸，而获得的HPV-16 E7- 基因经DNA测序，结果表明该三个三联密码子分别改变为GGC，GGC和GGT，均编码甘氨酸，证 明基因突变成功。
[0085] D.获得重组腺相关病毒载体rAAV/HPV-16 E7和rAAV/HPV-16 E7?:采用DNA连 接技术，分别将上述获得的HPV-16 E7片段或四个HPV-16 E7? DNA片段之一（3个两点突 变，1 个三点突变）插入 pAAV/p5、pAAV/CMVp、pAAV/SV40p 和 pAAV/ β -actinp 这四种 rAAV 载体中的一个中。为插入该基因片段，首先进行酶切反应，然后进行连接反应。其中，酶切 反应体系为：l〇〇ng质粒和50ng HPV-16 E7或E7m DNA片段；IOU限制性内切酶BamH I和 Sal I (购自美国Promega公司），2· 5μ1 IOX缓冲液C以及19. 5μ1去离子水；反应条件 为：在37°C下水浴4小时；
[0086] 连接反应体系为：50ng酶切后的质粒，50ng HPV-16 E7或HPV-16 E7m DNA片段， IOIU T4DNA连接酶（购自美国Promega公司），1·5μ1 10XT4DNA连接缓冲液以及11·5μ1 去离子水；反应条件为：4°C，8小时。最后分别得到携带有ρ5启动子、CMV启动子、SV40早 期启动子或β蛋白（β-actin)启动子和HPV-16 Ε7?基因或HPV-16E7基因的重组腺相关 病毒载体，分别对应四种启动子的携带HPV-16 E7m基因（包含HPV-16 ETni2^HPV-Ie E7"22、 HPV-16 ETni2JPHPV-Ie E7"3中的一种）的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16 E7m，分 别对应四种启动子的携带HPV-16 E7基因的重组腺相关病毒载体统称为AAV/HPV-16 E7。
[0087] D.获得重组腺相关病毒载体质粒AAV/HPV-16 E7和AAV/HPV-16 E7?:分别将连接 后的AAV/HPV-16 E7?和AAV/HPV-16 E7转化基因工程大肠杆菌（E. coli)DH5a感受态细 胞（美国Invitrogen公司），用含100 μ g/mL氨节青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白 色单菌落，提取质粒并纯化，分别得到AAV/HPV-16 E7?质粒和AAV/HPV-16E7质粒。
[0088] F.质粒检测：将获得的AAV/HPV-16 E7?质粒和AAV/HPV-16 E7质粒以限制性内 切酶BamH I和Sal I (购自美国Promega公司）进行酶切分析，以鉴定是否构建成功。酶 切反应条件和方法如上述（二.C)。对构建的AAV/HPV-16 E7?和AAV/HPV-16 E7载体进行 的酶切分析。酶切分析的结果如图4所示（以AAV/CMVp/HPV-16 ET^AAV/SV^p/HPV-ie E7m、AAV/ β -actinp/HPV-16 ，泳道 1-4、5-8、9-12 分别为携带 CMV 启动子、SV40 早期启动子以及 β-actin 启动子的 AAV/HPV-16 Ε?^ρΑΑν/ΗΡν-ΙΘ Ε?^^ΑΑν/ΗΡν-ΙΘ E7"23和AAV/HPV-16 ETnini3)。分析结果表明携带人乳头瘤病毒16型（HPV-16)的E7或多点突变 型E7?基因的重组腺相关病毒载体构建成功。
[0089] 实施例2、重组腺相关病毒（rAAV)的制备及病毒滴度测定
[0090] 材料及其来源：
[0091] A.实施例1构建的携带HPV-16 E7?和HPV-16 E7抗原基因的重组腺相关病毒载 体（AAV/HPV-16 E7nn和 AAV/HPV-16 E7)。
[0092] 含AAV的R印基因和Cap基因的辅助质粒pHelper :由本专利申请的发明 人刘勇等人构建成功（Liu, Y.，Santin AD.，Mane M.，Chiriva-Internati, M.，Parham GP. ,Ravaggi A. , and Hermonat, P. L. Transduction and Utility of the Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Gene into Monocytes and Dendritic Cells by Adeno-Associated Virus. Journal of Interferon and Cytokine Research. 20:21 - 30. 2000)。
[0093] C.含有整合于细胞染色体并表达的腺病毒基因 （EU E2A、E4、VAI和VAII基因） 的AAV-HEK293细胞：由由本专利申请的发明人刘勇等人建立（Liu, Y.，Santin AD.，Mane M.,Chiriva-Internati, Μ. , Parham GP. , Ravaggi A. , and Hermonat, P. L. Transduction and Utility of the Granulocyte-Macrophage