cFv诱导表达。
[0192] B.进行超声破碎和SDS-PAGE检测。
[0193] 为了检测CAPscFv在大肠杆菌BL21 (DE3)中是否能进行正常表达，利用SDS-PAGE 进行检测，并探究了目的蛋白的表达位置及是否形成包涵体。SDS-PAGE步骤如下：
[0194] (1)样品前处理
[0195] 取诱导前的500 μ L菌液，5000rpm离心5min，取200 μ L用PBS重悬，作为诱导前 对照；剩余4. 5mL诱导后培养物，5000rpm离心5min，去上清，菌体用2. 5mL PBS进行重悬。 取其中500 μ L菌液保存于4°C，即诱导后全蛋白。剩余2mL在冰水混合物中进行超声破碎。 条件：超声Is、间歇3s，全程99次，功率250W。
[0196] 将超声破碎的菌液在4°C，13000rpm离心8min，收集上清和沉淀，沉淀用2mL PBS 重悬。分别取15 μ L诱导前后菌液、破碎上清和沉淀于PCR管中，加入12 μ L 2XSDS-PAGE 上样缓冲液和3 μ L β -巯基乙醇，混匀，用沸水煮5min，备用。
[0197] (2)聚丙烯酸胺凝胶的制备：
[0198] 12%分离胶：水 I. 6mL，30%丙烯酰胺 2mL，I. 5M Tris-HCUpH = 8. 3) I. 3mL，10% SDS 50 μ L，10 %过硫酸铵50 μ L，TEMED 4 μ L。各组分添加后迅速混勾，加入组装好的制胶 板中，待加到胶板约2/3高度时，在其上层用异丙醇封住，封至整个胶板顶端。室温放置Ih 左右（视室温而定），将胶板整体倾斜，观察是否凝固，若凝固去除异丙醇，用滤纸吸干，取 干净的梳子插入制胶板缝隙。
[0199] 6%浓缩胶：水1.4!1^，30%丙烯酰胺0.3311^，1.511^8-!1(：1(口!1 = 6.8)0.2511^， 10% SDS 20 μ L，10%过硫酸铵20 μ L，TEMED 4 μ L。各组分添加后立即混勾，沿着梳子缝隙 灌胶，到胶快装满时轻轻压下梳子，赶走气泡，室温放置40min。轻轻晃动梳子，观察浓缩胶 是否凝固，待凝固后拔去梳子，即完成制胶过程。
[0200] (3) SDS-PAGE ：
[0201] 按照电泳仪说明书将凝胶板固定在支架上，放入电泳槽中，加入IX电泳缓冲液。 负极处加电泳液至没过上样孔，正极处至没过正极，用上样针将3个菌体的诱导前、后，破 碎上清、沉淀样品依次加入上样孔中，各15 μ L。在样品左侧上10 μ L蛋白Marker。将电泳 装置与电源连接，先用80V电压将溴酚蓝条带跑过浓缩胶和分离胶的交界处，然后用100V 电压跑胶至溴酚蓝条带离胶板底部0. 5cm处，停止电泳。
[0202] (4)染色和脱色
[0203] 电泳完毕后将装置小心拆卸，凝胶置于200mL考马斯亮蓝R-250染色液中染色，室 温轻摇过夜。转天，将凝胶用无菌水冲洗干净，脱色两次。每次用IOOmL脱色液（甲醇7mL， 乙醇30mL，水63mL)脱色lOmin，至条带清晰后利用成像仪成像。结果见图9、10。
[0204] C.纯化 CAPscFv 抗体
[0205] 用Ni-NTA柱纯化超声破碎后的上清。步骤如下：
[0206] (1)所用试剂在使用之前均需超声15分钟，以去除溶液中的气泡。
[0207] (2) 10mLl*Bind Buffer缓慢加入柱子中，4°C下静置30分钟。
[0208] (3)打开两端的塞子，让液体缓慢流出，加入超声破碎后的上清液5mL，4°C下静置 60分钟。
[0209] (4)打开两端的塞子，让液体缓慢流出，加入IOmL l*washing buffer，收集流出 液。
[0210] (5)加入 4mLl*elution buffer，收集流出液。
[0211] D. SDS-PAGE检测纯化后的蛋白。结果见图11。条带单一的泳道对应的蛋白样品 在4°C下，用PBS透析3天。
[0212] 实施例4 :间接竞争ELISA检测CAPscFv
[0213] 利用间接竞争ELISA对纯化后的CAPscFv活性进行初步鉴定。包被原为CAP-0VA， 封闭液为〇. 5%的乳粉，氯霉素作为标准品。计算IC50值。间接竞争ELISA步骤如下：
[0214] (1)包被：取 CAP-0VA，0· 1 μ g/ 孔包被 96 孔酶标板 12_16h。
[0215] (2)洗板：倾去包被液，PBST洗3次，拍干。
[0216] ⑶封闭：每孔加入200 μ L，0.5%的乳粉，37°C封闭lh。
[0217] (4)洗板：倾去封闭液，PBST洗3次，拍干。
[0218] (5)向酶标板中分别加入标准品50 μ L。
[0219] (6)加抗体：将纯化后的CAPscFv稀释6倍，取50 μ L加入到各浓度标准品的酶标 板中，37°C孵育lh。
[0220] (7)洗板：倾去scFv抗体上清液，PBST洗4次，拍干。
[0221] (8)显色：加 AP 显色底物 ρΝΡΡ，100μ!7 孔，37°C显色 20min。
[0222] (9)终止：加3M NaOH终止液，50 μ L/孔，在405nm波长下用酶标仪读取OD405数值。
[0223] 经过间接竞争ELISA，CAPscFv用PBS稀释6倍，显色20min。ELISA结果如下：
[0225] 氯霉素标准溶液从500ng/mL向下四倍稀释六个浓度，用间接竞争ELISA法进行测 定。根据吸光度值计算抑制率，建立了如图12所示的ELISA方法的标准抑制曲线，由四个 点可得到一个线性回归方程y = 15. 7331n (X)+32. 868 (R2= 0. 9988)，通过计算得到检测灵 敏度（比50值）为2.97±0.52即/1^、检测限（1(：15值）为0.33±0.111^/1^，这一检测灵 敏度可用于食品样品中氯霉素残留的初步筛查。
【主权项】
1. 一种抗氯霉素scFv的抗体基因，其特征在于：其包括重链基因和轻链基因，该基因 由714个核苷酸组成，所述重链基因的序列见序列1，轻链基因的基因序列见序列2。2. 由权利要求1所述基因编码的抗氯霉素scFv的抗体。3. 根据权利要求2所述的抗氯霉素scFv的抗体，其特征在于：重链可变区由117个氨 基酸组成，柔性链接区由15个氨基酸，轻链可变区由108个氨基酸组成。4. 含有权利要求1所述的抗体基因的载体。5. 含有权利要求1所述的抗体基因的基因工程菌。6. 权利要求4所述的载体或权利要求5所述的基因工程菌在制备抗氯霉素scFv抗体 中的应用。7. -种氯霉素抗体基因重链可变区和轻链可变区的筛选方法，其特征在于：步骤如下 ⑴将抗体基因的重链可变区、轻链可变区进行PCR扩增，与T载体连接并转化大肠杆菌 感受态细胞，筛选阳性克隆后进行大规模测序，利用序列比对软件对测序后的结构进行序 列比对分析； ⑵将氯霉素单克隆抗体进行酶解，获得Fab水解片段，并将水解后的重链和轻链分别 进行质谱鉴定； ⑶将大规模测序结果转换为氨基酸序列，与质谱鉴定结果所获得的氨基酸片段进行序 列比对分析，从测序结果中筛选与质朴鉴定结果一致的序列，从而获得目标抗体基因的重 链可变区和轻链可变区。
【专利摘要】本发明涉及一种抗氯霉素scFv的抗体基因及应用，涉及特异性单链抗体基因的筛选、特异性单链抗体基因的序列测定、单链抗体的制备、抗体的活性测定，该抗体基因包含编码重链可变区(117个氨基酸)、柔性链接区(15个氨基酸)和轻链可变区(108个氨基酸)的核苷酸序列，如序列表SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2所示，将该抗体基因与碱性磷酸酶进行融合表达后，获得了具有活性的单链抗体，活性检测结果显示该抗体对氯霉素的检测灵敏度为2.97(g/kg。该抗体在氯霉素的检测中具有重要的应用价值。
【IPC分类】C12N15/13, C12N15/70, G06F19/22, C07K16/44, C12N1/21
【公开号】CN105177016
【申请号】
【发明人】王硕, 杜欣军, 李萍, 周晓楠
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月17日