抗氯霉素scFv的抗体基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域和免疫学检测领域,具体涉及一种抗氯霉素 scFv 的抗体基因及应用。 技术背景
[0002] 氯霉素是一种广谱抗生素,最早是从土壤中的委内瑞拉放线菌中发现的,但现在 主要靠化学合成的手段生产。氯霉素不仅能够有效的作用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性 菌,对立克次氏体、支原体和衣原体也具有抑制作用。该药的抑菌机理,是通过与细菌的核 糖体50s亚基的可逆结合,阻止氨基酰-tRNA与核糖体结合,抑制肽酰基转移酶的作用,从 而达到抑菌、杀菌的效果。由于氯霉素价格便宜且药效显著,因此在畜牧业生产中被广泛用 于治疗败血症、肺、消化系统及泌尿系统感染。在水产养殖领域,由于氯霉素的广谱、高效的 杀菌能力,也曾广泛地用于治疗气一单胞菌等引起的鱼类疾病。自1949年氯霉素应用于临 床后,在一些感染性疾病,尤其是伤寒流行中取得良好疗效,但也于1950年发现本品可造 成严重致死性血液系统毒性。
[0003] 目前,越来越多的国家都开始高度重视氯霉素兽药的残留问题。欧盟、美国等均 在相关法规中限定氯霉素残留限量标准为"零容许量",日本于2006年实施的《肯定列表制 度》中关于氯霉素的残留量也规定为不得检出,为此,我国农业部己将氯霉素从2000年的 《中国兽药典》中删除,而《动物性食品兽药残留规定》中则明确规定氯霉素在食品当中不 得检出,一旦发现其残留量超标,一律禁止出口。农业部公告第193号(2002-4-27)发布的 《食品动物禁用兽药及其化合物清单》中,将氯霉素列为禁用药。
[0004] 因为这类抗生素的含量极微,因此要求高度灵敏的检测技术。已报道的氯霉素残 留量测定方法有气相色谱(GC)法、酶联免疫吸附(ELISA)等。GC法使用高灵敏度的电子捕 获检测器,因而对样品的净化要求严格,并增加了分析流程时间。这就迫切需一种新的快速 检测的方法;普通的酶联免疫法虽灵敏度高、样品容量大,却存在实验动物需量大、饲养周 期长,不同动物个体对农兽药敏感程度不同,造成抗体差异大等问题;单克隆抗体作为第二 代抗体,由于制备和筛选过程繁琐,且对操作技术要求很高,克隆后的细胞遗传容易不稳定 等原因,不利于广泛应用。
[0005] 基因工程抗体的优势表现在节省实验动物及饲养时间、技术简便、易于投入生产、 遗传信息具有可操作性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处,提供一种针对性强、稳定性高、制备 方便的抗氯霉素的scFv抗体及编码该抗体的基因序列。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0008] -种抗氯霉素 scFv的抗体基因,其包括重链基因和轻链基因,该基因由714个核 苷酸组成,所述重链基因的序列见序列1,轻链基因的基因序列见序列2。
[0009] 由抗氯霉素 scFv的抗体基因编码的抗氯霉素 scFv的抗体。
[0010] 而且,重链可变区由117个氨基酸组成,柔性链接区由15个氨基酸,轻链可变区由 108个氨基酸组成。
[0011] 含有抗氯霉素 scFv的抗体基因的载体。
[0012] 含有抗氯霉素 scFv的抗体基因的基因工程菌。
[0013] 含有抗氯霉素 scFv的抗体基因的基因工程菌或含有抗氯霉素 scFv的抗体基因的 载体在制备抗氯霉素 scFv抗体中的应用。
[0014] 一种氯霉素抗体基因重链可变区和轻链可变区的筛选方法,步骤如下
[0015] ⑴将抗体基因的重链可变区、轻链可变区进行PCR扩增,与T载体连接并转化大肠 杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆后进行大规模测序,利用序列比对软件对测序后的结构进 行序列比对分析;
[0016] ⑵将氯霉素单克隆抗体进行酶解,获得Fab水解片段,并将水解后的重链和轻链 分别进行质谱鉴定;
[0017] ⑶将大规模测序结果转换为氨基酸序列,与质谱鉴定结果所获得的氨基酸片段进 行序列比对分析,从测序结果中筛选与质朴鉴定结果一致的序列,从而获得目标抗体基因 的重链可变区和轻链可变区。
[0018] 本发明的优点和积极效果:
[0019] (1)本申请通过查阅大量NCBI数据设计了兼并引物,该引物能全面地覆盖鼠源 抗体重链和轻链的多样性,尤其是轻链引物除了包括一般的kappa轻链引物,还包括了 lambda轻链引物,以防止部分目的基因的丢失。
[0020] (2)本发明选用杂交瘤细胞作为制备抗氯霉素 scFv抗体的基因来源,省去了免 疫、饲养动物带来的繁琐,针对性更强;
[0021 ] (3)本发明建立了一种新的、可靠性强的获得特异性抗体基因的方法,将抗体的质 谱鉴定和大规模测序相比对,从而获得目标抗体基因;
[0022] (4)本发明的制备方法节省时间、技术简便、易于发展下游生产、遗传信息可操作 且稳定。
【附图说明】
[0023] 图1为氯霉素抗体可变区的扩增。图中I :VL片段;2:VL片段;M:DNA Marker DL2000〇
[0024] 图 2 为氯霉素 Fab 的检测。图中 M :Protein Molecular Weight Marker ;1、2、3 : 纯化后的氯霉素 Fab。
[0025] 图3为轻链可变区测序结果与质谱的比对。图中Sequence为VL的氨基酸序列, 1、2、3、4为质谱测序结果。
[0026] 图4为重链可变区测序结果与质谱的比对。图中Sequence为VH的氨基酸序列, 1、2、3、4、5、6为质谱测序结果。
[0027] 图 5 为单链抗体基因(scFv)的扩增。1、2 :scFv ;M :DNA Marker DL2000。
[0028] 图 6 为 PCR 筛选 scFv-pMD18-T 阳性克隆。1-18 :PCR 筛选结果;M :DNA Marker DL2000〇
[0029] 图7为PCR筛选重组表达质粒。M :DNA Marker DL2000 ;1-10 :PCR筛选结果。
[0030] 图 8 为重组表达质粒的酶切验证。Ml :DNA Marker DL2000 ;M2 :DNA Marker Ikb ; 1-4 :重组表达质粒的酶切。
[0031] 图9为氯霉素单链抗体的诱导表达。Μ:标准蛋白分子量;I :CAPSCfv-pLIP6/ GN-BL21 诱导前;2、3、4、5、6 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 不同克隆菌株诱导后
[0032] 图 10 为单链抗体表达形式的检测。M :Protein Molecular Weight Marker ; 1 : CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 I 号诱导前;2 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 I 号诱导后;
[0033] 3 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 1 号破碎后上清;4 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 1 号破 碎后沉淀;
[0034] 5 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 5 号诱导后;6 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 5 号破碎后 上清;
[0035] 7 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 5 号破碎后沉淀。
[0036] 图 11 为单链抗体纯化后的检测。M :Protein Molecular Weight Marker ; I :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 I 号诱导前;2 :CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 I 号诱导后;2 : CAPscfv-pLIP6/GN-BL21 1 号纯化后。
[0037] 图12为单链抗体的活性检测。
[0038] 具体的实施方式
[0039] 为了理解本发明,下面结合实施例对本发明作进一步说明:下述实施例是说明性 的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0040] 为了实现本发明目的,申请人利用重组DNA技术,将针对氯霉素具有广谱特异性 的鼠源杂交瘤细胞株10A3B6E的抗体重链、轻链可变区基因进行体外扩增,经过大量测序 后,将测序结果与Fab形式抗体的质谱结果进行序列比对,筛选出目标基因。
[0041] 本发明利用融合表达技术,获得了具有氯霉素特异识别活性的单链抗体(SC