eppendorf Bio-PhotoMeter plus测定浓度，-20°C 保存。
[0118] 6、亚克隆实验
[0119] A. scFv 连接 pMD18_T vector
[0120] 连接体系：
[0122] 16°(：连接1611。
[0123] B.连接产物转化JM109感受态细胞
[0124] (1)将100 μ L JM109感受态细胞放置冰上解冻。
[0125] (2)将连接产物10 μ L加入到50 μ L感受态细胞中，轻轻混匀后放置冰上30min。
[0126] (3)将混合物42°C水浴60s，然后迅速放置冰上冷却2min，注意不可晃动。
[0127] (4)加入800 μ L LB液体培养基，37°C，200rpm振荡培养lh。
[0128] (5) 5000rpm，离心5min，倒掉培养基，大约留100 μ L涂布含有抗生素 Amp的LB固 体培养基平板上，37 °C生长过夜。
[0129] C.验证阳性克隆
[0130] 挑取Amp平板上的单克隆菌落于10 μ L无菌水中重悬，用Μ13通用引物做菌落PCR 实验。结果见图6。
[0131] (I)PCR 体系：
[0132] CN 105177016 A 说明书 10/14 页
[0135] (3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
[0136] D.获得重组质粒 scFv-pMD18_T
[0137] (1)挑取Amp平板上的单克隆，转接到LB液体培养基中，37°C，200rpm，过夜培养。
[0138] (2)天根质粒小提试剂盒提取重组质粒scFv-T，步骤如下：
[0139] ①柱平衡步骤：将吸附柱放入收集管，向吸附柱中加入500 yL平衡液BL， 13000rpm离心lmin，吸弃收集管中废液，将吸附柱放回收集管中。
[0140] ②取l_5mL过夜培养的菌液，加入到离心管中，13000rpm离心lmin，尽量吸弃上 清，菌液较多，可分多次离心后将菌体收集到同一离心管中。
[0141] ③向含有菌体沉淀的离心管中加入250 μ L Buffer Pl (Buffer Pl在使用之前要 确保已加入RNase A)，使用移液器吹打或涡旋彻底悬浮细菌沉淀，如果菌体为彻底混匀，会 影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
[0142] ④继续向离心管中加入250 μ L Buffer P2,上下翻转混匀6-8次，操作要温和，确 保菌体充分裂解，此时菌液会变得清亮粘稠，所用时间不要超过5min，以免质粒受到损伤。
[0143] ⑤向离心管中加入350 μ L Buffer P3,立即温和地上下翻转6-8次，此时会出现白 色絮状沉淀，13000rpm离心10min。
[0144] ⑥小心吸取上清，注意不要吸到沉淀，将上清加入到吸附柱中
[0145] ⑦13000rpm离心lmin，吸弃收集管中废液，吸附柱放回收集管。
[0146] ⑧向吸附柱中加700 yL Buffer PW(Buffer PW使用之前要加入无水乙醇）， 13000rpm离心lmin，吸弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0147] ⑨向吸附柱中加入500 μ L Buffer PW(请检查是否已加入无水乙醇），13000rpm 离心lmin，吸弃收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管。
[0148] ⑩13000rpm离心2min，吸弃收集管中废液。将吸附柱开盖置于室温lOmin，以彻 底晾干吸附膜上残余的Buffer PW。
[0149] (11)取吸附柱放置于干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加50 μ L无菌水， 室温放置l_2min，13000rpm离心lmin，将质粒溶液收集到离心管中，-20°C保存质粒。
[0150] 7、CAP-scFv-pLIP6/GN 表达质粒的构建
[0151] A. scFv-pMD18-T重组质粒与pLIP6/GN空质粒的双酶切。
[0152] (1)用限制性内切酶Sfi I酶切scFv-T，酶切体系如下：
[0154] 50 °C水浴温育过夜。
[0155] (2)用限制性内切酶Not I继续酶切scFv-T，将上一步酶切体系取
[0156] 出水浴锅，冷却至室温，向体系中加入I yL Not I，37°C水浴温育I. 5h。
[0157] (3) scFv 连接 pLIP6/GN
[0158] 连接体系：
[0160] 16°(：连接1611。
[0161] B.连接产物转化JM109感受态细胞
[0162] (1)将100 μ L JM109感受态细胞放置冰上解冻。
[0163] (2)将连接产物10 μ L加入到50 μ L感受态细胞中，轻轻混匀后放置冰上30min。
[0164] (3)将混合物42°C水浴60s，然后迅速放置冰上冷却2min，注意不可晃动。
[0165] (4)加入800 μ L LB液体培养基，37°C，200rpm振荡培养lh。
[0166] (5) 5000rpm，离心5min，倒掉培养基，大约留100 μ L涂布含有抗生素 Amp的LB固 体培养基平板上，37 °C生长过夜。
[0167] C.验证阳性克隆
[0168] (1)菌落PCR验证
[0169] ①挑取Amp平板上的单克隆菌落于10 μ L无菌水中重悬，用phoA通用引物做菌落 PCR实验。
[0170] ② PCR 体系： CN 105177016 A 说明书 12/14 页
[0174] ④琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。结果见图7。
[0175] (2)酶切验证
[0176] 提取菌落PCR验证为阳性的单克隆的质粒，用Sfi I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶 电泳检测酶切产物。结果见图8。
[0177] (3)测序
[0178] 验证正确的菌种接种于LB-Amp中过夜培养。菌液送至北京金维智生物公司测序， 所用引物为phoA。最后利用MEGA5软件将测序结果同已知的VH15号、\1号和Linker序列 进行对比，scFv基因序列一致的菌株即为CAPscFv-pLIP6/GN-BL21菌株。
[0179] 实施例3 :CAP-scFv-pLIP6/GN表达载体的重组表达
[0180] 1、BL21(DE3)感受态细胞的制备
[0181] (1)将_80°C保存的BL21 (DE3)菌种在LB固体平板上划线，37°C倒置培养过夜。
[0182] (2)挑取单克隆，接种于5mL LB液体培养基中，37°C，180rpm，培养过夜。
[0183] (4)取100 μ L过夜培养的菌液，转接至IOOmL Psi培养基中，37°C振荡培养3h左 右，至0D600为0· 4-0. 5左右。
[0184] (5)将菌液转至IOOmL无菌离心管中，冰上放置30min。4°C，4000rpm离心3min。
[0185] (6)弃上清，加入80mL tfb I，用移液器轻轻吹打，充分重悬细胞，置于冰上 20min。4000rpm 4°C 离心 3min。
[0186] (7)弃上清，加入IOmL tfb II，用移液器轻轻吹打，充分重悬细胞，置于冰上 20min。在冰盒上100 μ L分装，液氮速冻，存于-80 °C冰箱备用。
[0187] 2、表达菌株的制备
[0188] 将6个重组质粒CAPscFvl、2、3、4、5、6_pLIP6/GN分别转入表达菌大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞中。挑取转化平板上生长的单克隆，接种于LB-Amp培养基中进行 37 °C过夜培养。
[0189] 3、诱导表达及SDS-PAGE检测
[0190] A. CAPscFv-pLIP6/GN-BL21 的诱导表达
[0191] 取50 μ L过夜培养的菌液，按1:100比例转接到新的5mL LB培养液（含100 μ g/mL Amp)中，培养3h左右，至0D600达到0. 8-1. 0时加入IPTG至终浓度为0. lmM，25°C 180rpm 培养过夜，进行s