Fv)。 经过重叠延伸PCR，用15个氨基酸（氨基酸序列（GGGGS)3，基因序列GGTGGAGGCG GTTC AG GCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG))组成的柔性连接肽将筛选到的重链、轻链连接成scFv 抗体基因片段，并将所得的scFv基因片段插入到pLIP6/GN表达载体上，构建重组质粒并化 学转化至表达型宿主菌中，获得了融合表达的抗氯霉素 scFv抗体。
[0042] 本发明还提供了氯霉素抗体基因重链可变区和轻链可变区序列，分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2 ;以及scFv重链、轻链的氨基酸序列，如序列18和序列19。
[0043] 本发明还提供了借助NCBI设计的兼并引物，用于扩增上述基因。其中轻链扩增引 物除了常用的kappa链引物还引入了 lambda链引物，以覆盖抗体可变区的多样性。
[0044] 本发明还提供了含有上述基因的载体和载体的宿主细胞。本发明还提供了上述 scFv抗体、编码该抗体的基因、含有该基因的载体、含有该载体的宿主细胞在制备抗氯霉素 scFv抗体中的应用。
[0045] 以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0046] 以下实施例中使用的试剂材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得 到。
[0047] 以下实施例中由于氯霉素通用半抗原在合成时简称为CAP，所以以下相应细胞、基 因、菌种等提到有关了氯霉素时均简称为CAP。
[0048] 实施例1 :CAP单克隆细胞总RNA的提取及cDNA的合成
[0049] I、CAP单克隆细胞株10A3B6E总RNA的提取
[0050] 取通过本实验室筛选得到的新鲜单克隆细胞株10A3B6E，利用Qigen Rneasy Mini Kit提总RNA，细胞株10A3B6E可产生抗CAP的单克隆抗体。
[0051] ⑴培养细胞至3-4 X IO6个，300 Xg离心5min，移去上清；
[0052] ⑵配制裂解液：Buffer RLT: β -疏基乙醇=Iml: 10 μ 1 ;
[0053] ⑶向离心后的细胞中加入350 μ I Buffer RLT裂解缓冲液，轻弹管壁，用移液枪吹 打，使缓冲液与细胞充分接触；
[0054] ⑷加入同等体积的70%的乙醇溶液，移液枪轻轻吸打混匀，注意不要离心；
[0055] ⑶取Qigen Rneasy Mini Kit中的硅胶柱，装入2ml收集管上，转移所有的样品到 柱子中，室温下12000rpm离心15s，弃去废液；
[0056] (6伽入700 μ I Buffer RWl到柱中，室温下12000rpm离心15s，弃去流出液；
[0057] ⑴加入500 μ 1用乙醇稀释的RPE缓冲液，洗涤柱子，lOOOOrpm，离心15s，弃上清；
[0058] ⑶加入500 μ I RPE缓冲液移入柱子，轻盖盖子，室温下lOOOOrpm，离心2min，冲洗 柱子；
[0059] ⑶把柱子放入一个试剂盒提供的新2ml收集管中，全速离心Imin ;
[0060] (W)把柱子转移到Qigen Rneasy Mini Kit提供的I. 5ml离心管中，取50 μ 1的无 RNA酶水（试剂盒提供）小心悬空滴加到柱子的膜上，静置3-5min，轻轻盖上盖子，室温下 1000 Orpm 离心 lmin，洗脱 RNA ;
[0061] (11)洗脱的RNA分装、标记后，冻存于-80 °C。
[0062] 2、CAP-cDNA 的合成
[0063] ⑴添加以下组分到I. 5ml离心管：
[0064] 組分 体积 RNA 3μ1 Primer[01igo(dT)i5] 1 μΙ Random Primer I μL 终体积 5μ1
[0065] ⑵合好盖，将离心管放入70°C水浴5min，然后立即放到冰上，至少5min，离心10s 收集浓缩物保持原始体积，一直放冰上；
[0066] ⑶准备反转录体系，各组分一直放冰上；
[0067] 反应体系组分 体积 Nuclease-Frco water 6μ1 Go Scrip! 5x Reaction BuJTor 4μ1 MgCh 2.5μΙ
[0068] PCR Nucleotide Mix ?μL Recombinant RNasion 0,5μ1 Go Sript Reverse TranscripLasc ΙμL 终体积 15μ1
[0069] ⑷上一步准备的反应体系与第一步的反应体系混合，终体积20 μ I ;
[0070] (5)退火：25°C，5min ;
[0071] (6)延伸：42 °C，Ih ;
[0072] (7)分装，-80 °C 冻存。
[0073] 实施例2 :CAP-scFv表达质粒的构建
[0074] I、PCR 扩增 Vh、\
[0075] 所用引物：(VL后引物和scFv后引物为引物在使用时均为等量使用）
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[0078] 其中K为kappa引物，L为lambda引物，用kappa前引物也能扩增lambda链，所 以没有单独的lambda前引物。
[0079] CN 105177016 A 说明书 7/14 页
[0084] 经PCR扩增，产物利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
[0085] 2、利用Qiagen凝胶纯化试剂盒胶回收目的片段
[0086] (1)准备干净的离心管，称重；
[0087] ⑵用干净的刀片切下琼脂糖凝胶上的目的片段，放入离心管中；
[0088] ⑶称重，计算切下的胶重量，加入3倍体积的Buffer QG到1倍体积凝胶中；
[0089] (4) 50°C孵育，lOmin，直至胶完全溶解，每隔2_3min颠倒一次；
[0090] (5)胶完全溶解后，检查溶液颜色是否为黄色，如溶液颜色成橘黄色或紫色，加 IOul 3M醋酸钠混匀；
[0091] (6)加一倍凝胶体积异丙醇到溶液中，混匀（IOOmg-IOOul异丙醇）；
[0092] (7)将试剂盒中的硅胶柱子放到2ml收集管；
[0093] ⑶结合DNA :将溶液加到柱子上，离心lmin，13000rpm(溶液体积超过800ul再离 心一次）；
[0094] (9)倒尽流出液，将柱子再放回到离心管中；
[0095] (10)加 0· 5ml Buffer QG 到柱子上，离心 lmin，13000rpm ;
[0096] (11)洗脱：倒尽流出液，加入750ul Buffer PE到柱子上，离心Imin ;
[0097] (11)倒尽流出液，离心 lmin，13000rpm ;
[0098] (I2)将柱子放到一个干净的I. 5ml离心管；
[0099] (1?洗提 DNA，加 50ul Buffer EB 或 pH 为 7. 0-8. 5 水到膜中间，离心 Imin ;
[0100] 3、利用 eppendorf Bio-PhotoMeter plus 测定 Vh和 V [浓度
[0101] 4、序列的测定与分析
[0102] (1)抗体的质谱鉴定
[0103] 将氯霉素单克隆抗体进行纯化，利用木瓜蛋白酶进行水解后，利用ProteinA吸附 抗体恒定区，获得纯化的Fab，利用SDS-PAGE进行检测（图2)，分别将重链和轻链切割下来 进行质谱鉴定。
[0104] ⑵抗体基因可变区的序列测定
[0105] 将重链可变区和轻链可变区连接到T载体中，进行规模化测序，每种片段测序 20-30个克隆，将测序获得的核酸序列翻译成氨基酸序列，与质谱测序结果，进行比对（图 3、4)。根据比对结果，选择与质谱测序结果最相近的VH15号和号继续后续实验。
[0106] 5、CAP_scFv 合成
[0107] (1)预拼接体系：
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[0117] 经PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5。切取约750bp左右的目的 条带，用Qiagen凝胶纯化试剂盒胶回收，