积含5%小牛血清的DMEM培养基代替病毒液的空白对照），置于5% C02、37°C环境中静置培养lh，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
[0138] 4、完成步骤3后，取所述6孔板，每孔加入含10%小牛血清的DMEM培养基，置于 5% C02、37°C环境中静置培养48h。
[0139] 5、完成步骤4后，取所述6孔板，收集细胞，用含0· 25% (质量比）胰酶的DMEM 培养基消化细胞，然后用PBS缓冲液洗涤两次，然后取（0. 5-1) X IO6个细胞，用500 μ L Binding Buffer轻柔的悬浮细胞，加入IOyL FITC标记的Annexin-V，再加入5 yL PUg 匀，避光反应5-15min后用流式细胞术定量检测。
[0140] 感染剂量为IMOI时的结果见图8。图8中，A为空白对照的检测结果，B为感染 rClone30病毒液的H印G2细胞的检测结果，C为感染rClone30/DR5病毒液的H印G2细胞的 检测结果，D为感染rClone30/TRAIL病毒液的H印G2细胞的检测结果，E为感染rClone30/ DR5-TRAIL病毒液的H印G2细胞的检测结果。
[0141] 感染剂量为10M0I时的结果见图9。图9中，A为空白对照的检测结果，B为感染 rClone30病毒液的H印G2细胞的检测结果，C为感染rClone30/DR5病毒液的H印G2细胞的 检测结果，D为感染rClone30/TRAIL病毒液的H印G2细胞的检测结果，E为感染rClone30/ DR5-TRAIL病毒液的H印G2细胞的检测结果。
[0142] 结果表明，rClone30/DR5-TRAIL 病毒、rClone30 病毒、rClone30/DR5 病毒和 rClone30/TRAIL病毒均能诱导肿瘤细胞发生凋亡，且细胞凋亡的程度对病毒剂量呈现剂量 依赖性，rClone30/DR5_TRAIL病毒的效果显著强于rClone30病毒、rClone30/DR5病毒和 rClone30/TRAIL 病毒。
[0143] 实施例7、重组病毒对肿瘤的治疗作用及病毒安全性检测
[0144] 一、rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤的治疗作用
[0145] 1、建立H22肝癌动物模型
[0146] (1)取H22细胞，用PBS缓冲液悬浮，得到IO6个细胞/mL的细胞悬液。
[0147] (2)取6周龄ICR小鼠，每只右侧腹股沟皮下注入剂量0. 2mL步骤（1)制备的细胞 悬液，正常饲养小鼠，10天后形成5-8mm直径的实体瘤的小鼠，即为模型小鼠。
[0148] 2、rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤的治疗作用
[0149] 将模型小鼠随机分为六组，每组10只，分别处理如下：
[0150] rClone30/DR5_TRAIL组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只 模型小鼠的实体瘤内注射0. 2mL实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液（含IO7Pfu 病毒）；
[0151] rClone30/DR5组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小 鼠的实体瘤内注射〇. 2mL实施例1制备的rClone30/DR5病毒液（含IO7Pfu病毒）；
[0152] rClone30/TRAIL组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型 小鼠的实体瘤内注射〇· 2mL实施例1制备的rClone30/TRAIL病毒液（含IO7Pfu病毒）；
[0153] rClone30/IL2组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小 鼠的实体瘤内注射〇· 2mL实施例1制备的rClone30/IL2病毒液（含IO7Pfu病毒）；
[0154] rCl〇ne30组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的 实体瘤内注射〇· 2mL实施例1制备的rClone30病毒液（含IO7Pfu病毒）；
[0155] 尿囊液组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体 瘤内注射〇. 2mL鸡胚尿囊液。
[0156] 每两天测量肿瘤体积，绘制肿瘤体积生长曲线。
[0157] 试验第0天（第0天指的是注射病毒液前）至试验第14天，尿囊液组10只小鼠 的肿瘤体积生长曲线见图10。试验第〇天（第〇天指的是注射病毒液前）至试验第14天， rCl〇ne30组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图11。试验第0天（第0天指的是注射病毒 液前）至试验第14天，rCl〇ne30/IL2组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图12。试验第0 天（第〇天指的是注射病毒液前）至试验第14天，rCl〇ne30/DR5组10只小鼠的肿瘤体积 生长曲线见图13。试验第0天（第0天指的是注射病毒液前）至试验第14天，rClone30/ TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图14。试验第0天（第0天指的是注射病毒液 前）至试验第14天，rCl〇ne30/DR5-TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图15。试验 第0天（第0天指的是注射病毒液前）至试验第14天，各试验组肿瘤平均体积见图16。
[0158] 结果表明，与 PBS 组相比，rClone30 病毒液、rClone30/IL2 病毒液、rClone30/DR5 病毒液、rClone30/TRAIL病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液对肿瘤有极显著的抑制效 果，rClone30 病毒液、rClone30/IL2 病毒液、rClone30/DR5 病毒液、rClone30/TRAIL 病毒 液之间效果差异不显著，rClone30/DR5_TRAIL病毒液与Clone30病毒液、rClone30/IL2病 毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液的效果有显著性差异。
[0159] 二、rClone30/DR5-TRAIL 病毒的安全性检测
[0160] 1、急性毒性试验
[0161 ] 取10只健康4-6周龄ICR小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射rClone30/ DR5-TRAIL病毒液（含IO7Pfu病毒），注射之后观察48h。
[0162] 小鼠均未出现如下任何不良反应：呼吸受到抑制、四肢步伐不平稳、瘫痪症状、惊 厥、皮毛战栗、死亡。
[0163] 2、亚急性毒性试验
[0164] 取10只健康4-6周龄ICR小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射rClone30/ DR5-TRAIL病毒液（含IO7Pfu病毒），注射之后观察4周。
[0165] 小鼠进水、进食、毛色、体重等方面均正常，无任何不良反应，无死亡。
[0166] 结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒对小鼠的正常生长无不良影响，安全性可靠。
【主权项】
1. 一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrCl〇ne30/ DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重 组新城疫病毒；所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL为具有序列表的序列3自5'末端第 2703-19872位核苷酸所示的DNA分子的质粒。2. 如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述重组质粒pBrCl〇ne30/ DR5-TRAIL为序列表的序列3所示的质粒。3. 如权利要求1或2所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述哺乳动物细胞为 BHK-21 细胞。4. 一种重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA如序列表的序列3自5'末端第 2703-19872位核苷酸所示。5. 权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的功 能为如下（a)和/或（b)和/或（c) : (a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；（c)治疗 肿瘤。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述（a)和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞 为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述（c)中，所述肿瘤为肝癌或神经胶质细 胞瘤。8. -种产品，包括权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒；所述产品的功能为 如下（a)和/或（b)和/或（c) : (a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；（c)治疗肿瘤。9. 如权利要求8所述的产品，其特征在于：所述（a)和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞 为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。10. 如权利要求8所述的产品，其特征在于：所述（c)中，所述肿瘤为肝癌或神经胶质 细胞瘤。
【专利摘要】本发明公开了一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用。本发明提供的重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19872位核苷酸所示的DNA分子的质粒。本发明还保护所述重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)治疗肿瘤。本发明为改善TRAIL抵抗以提高抗肿瘤效果提供了全新的方法，对于肿瘤治疗具有重大的应用价值。
【IPC分类】A61K35/768, A61K48/00, C12R1/93, A61P35/00, C12N7/01
【公开号】CN105176937
【申请号】
【发明人】李德山, 孙田, 何金娇
【申请人】哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月2日