一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，目前全球每年大约有1100多万人罹 患癌症，并有800多万人死于癌症。
[0003] 长期以来，人们治疗癌症的方法主要以传统的手术切除和放化疗为主，这些手段 可以在一定程度上控制肿瘤的发展，但是对于晚期肿瘤扩散患者的疗效有限，并且这些手 段同时对人体的正常细胞产生严重的创伤。
[0004] 因此，急需一种新的治疗恶性肿瘤的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用。
[0006] 本发明提供的重组新城疫病毒（命名为rClone30/DR5-TRAIL病毒），其制备方 法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L 质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述重组质粒pBrCl〇ne30/ DR5-TRAIL为具有序列表的序列3自5'末端第2703-19872位核苷酸所示的DNA分子的质 粒。序列表的序列3自5'末端第2703-19872位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30/ DR5-TRAIL病毒的基因组DNA。所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL具体可为序列表的序 列3所示的质粒。所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
[0007] rClone30/DR5-TRAIL病毒的制备方法具体如下：
[0008] (1)将所述重组质粒 pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N 质粒、pBL-P 质粒和 pBL-L 质 粒共转染BHK-21细胞（每IX IO6个细胞转染1 μ g重组质粒ppBrClone30/DR5-TRAIL、 0· 5yg pBL-N 质粒、0· 25yg pBL-P 质粒和 0· I yg pBL-L 质粒），置于 5% C02、37°C 环境中 静置培养72h ;
[0009] (2)取步骤（1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接 种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液（其中含有 rClone30/DR5-TRAIL 病毒）。
[0010] rClone30/DR5-TRAIL病毒的制备方法具体如下：
[0011] (1)将所述重组质粒 pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N 质粒、pBL-P 质粒和 pBL-L 质粒共转染BHK-21细胞（每I X IO6个细胞转染1 μ g重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、 0· 5yg pBL-N 质粒、0· 25yg pBL-P 质粒和 0· I yg pBL-L 质粒），置于 5% C02、37°C 环境中 静置培养72h ;
[0012] (2)取步骤⑴得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于 9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0013] (3)取步骤（2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于 37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0014] (4)取步骤（3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于 37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
[0015] (5)将步骤⑵得到的鸡胚尿囊液、步骤（3)得到的鸡胚尿囊液和步骤（4)得到的 鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30/DR5-TRAIL病毒液。
[0016] 本发明还保护一种重组新城疫病毒（命名为rClone30/DR5-TRAIL病毒），其基因 组对应的DNA如序列表的序列3自5'末端第2703-19872位核苷酸所示。
[0017] 本发明还保护以上任一所述的重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的 功能为如下（a)和/或（b)和/或（c) : (a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；（c)治 疗肿瘤。所述（a)和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。所 述（a)和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞或人神经胶质细胞瘤细胞。所述（a) 和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞为H印G2细胞或U251细胞。所述（c)中，所述肿瘤为肝 癌或神经胶质细胞瘤。所述（c)中，所述肿瘤为H22细胞引起的肿瘤。
[0018] 本发明还保护一种产品，包括以上一所述的重组新城疫病毒；所述产品的功能为 如下（a)和/或（b)和/或（c) : (a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；（c)治疗肿瘤。 所述（a)和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。所述（a) 和/或所述（b)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞或人神经胶质细胞瘤细胞。所述（a)和/ 或所述（b)中，所述肿瘤细胞为H印G2细胞或U251细胞。所述（c)中，所述肿瘤为肝癌或 神经胶质细胞瘤。所述（c)中，所述肿瘤为H22细胞引起的肿瘤。
[0019] 新城疫病毒（Newacstle disease virus，NDV)为不分节段的单股负链RNA病毒， 隶属副粘病毒科副粘病毒亚科的禽副粘病毒属，能够特异地杀伤人肿瘤细胞，而对人正常 细胞无明显影响。NDV作为病毒载体可以通过本身的复制扩增带动所携带的基因的表达水 平，也可以直接影响肿瘤宿主细胞的凋亡及坏死，从而抑制肿瘤细胞的生长。
[0020] 本发明利用反向遗传操作技术将DR5基因区段和TRAIL基因区段同时插入新城疫 病毒基因组F基因和HN基因之间（DR5基因区段为人DR5基因全长基因，其表达后定位于 肿瘤细胞表面；TRAIL基因区段为人TRAIL基因的胞外区，分泌表达到细胞外），得到了重组 病毒rClone30/DR5-TRAIL。新城疫病毒本身能较小幅度上调肿瘤细胞表面DR5的表达量， 插入的外源基因 DR5能大幅度上调DR5的表达，从而可以提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。 外源基因 TRAIL在新城疫病毒基因组上的联合表达减少了 TRAIL的再次用药，减轻了多种 药物同时注射所造成的痛苦，表达的TRAIL与DR5结合后，进一步诱导肿瘤细胞凋亡。本发 明为改善TRAIL抵抗以提高抗肿瘤效果提供了全新的方法，对于肿瘤治疗具有重大的应用 价值。
【附图说明】
[0021] 图1为重组病毒感染肿瘤细胞后DR5蛋白的表达。
[0022] 图2为重组病毒感染肿瘤细胞后TRAIL蛋白的表达。
[0023] 图3为DR5基因的相对表达量。
[0024] 图4为TRML基因的相对表达量。
[0025] 图5为caspase3基因、caspase7基因和caspase8基因的相对表达量。
[0026] 图6为重组病毒对H印G2细胞的抑制率。
[0027] 图7为重组病毒对U251细胞的抑制率。
[0028] 图8为感染剂量为IMOI时重组病毒对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0029] 图9为感染剂量为10M0I时重组病毒对肿瘤细胞的杀伤效果。
[0030] 图10为尿囊液组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
[0031] 图11为rClone30组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
[0032] 图12为rClone30/IL2组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
[0033] 图13为rClone30/DR5组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
[0034] 图14为rClone30/TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
[0035] 图15为rClone30/DR5-TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
[0036] 图16为各试验组肿瘤平均体积。
【具体实施方式】
[0037] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为 自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值。鼠抗人DR5单克隆抗体：sigma，货号SAB 4700538。FITC标记的兔抗鼠 ：santa cruze，货号SC-358946。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7. 2、0.1 M的 PBS缓冲液。
[0038] BHK-21细胞：ATCC，ATCC编号为CRL-13001。！fepG2细胞（人肝癌细胞）：中国科 学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为TCHu 72。U251细胞（人神经胶质 细胞瘤细胞）：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为TCHu 58。胰 酶：Sigma，产品目录号为8049-47-6。H22细胞（小鼠肝癌细胞）：ATCC公司，产品目录号为 58426。ICR小鼠：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
[0039] 提及 "pBrClone30 质粒"的文献'Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase'，, Zheng LV, Asian Pac J Cancer Ptev.;哈尔滨博翱医药技术开发有限公司。
[0040] 提及 "pBL-N 质粒"、"pBL-P 质粒"和 "pBL-L 质粒"的文献=Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin