2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy, Fuliang Bai, Immunology letters.;哈尔滨博翱 医药技术开发有限公司。
[0041] pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和 L基因，其中F基因和HN基因之间具有HpaI和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、 pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养（pBL-N质粒、pBL-P质粒 和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组），得到毒株Clone30〇
[0042] 鸡血红细胞凝集（HA)试验的具体方法如下：（1)在血凝板第一排的1-12孔各加 入50 μ L生理盐水；（2)在第1孔中加入50 μ L待测病毒液，混匀后吸50 μ L到第2孔，如 此倍比稀释直到第10孔，第11孔混匀后弃除50 yL ; (3)在1-12孔中各加入50 yL 1 %鸡 血红细胞；（4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
[0043] 鸡血红细胞凝集抑制（HI)试验的具体方法如下：（1)在血凝板的1-12孔各加 入25 μ L生理盐水；（2)第1孔加入待检血清25 μ L，混匀后吸25 μ L至第2孔，倍比稀释 直至第10孔，第11孔混匀后弃除25 yL; (3)在1-12孔中各加入25 yL实施例1制备的 rClone30病毒液（4个血凝单位），室温静置30min ; (4)在1-12孔中各加入25 μ L 1 %鸡 血红细胞；（5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
[0044] 实施例l、rClone30/DR5-TRAIL病毒液的制备
[0045] 一、重组质粒的构建
[0046] 1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
[0047] 序列表的序列1中，自5'末端第1至6位核苷酸为限制性核酸内切酶Hpa I的识 别序列，第7至第12位核苷酸为Kozak序列，第13至1248位核苷酸为DR5基因区段（全 长DR5基因），第1249至1254位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。
[0048] 2、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产 物。
[0049] 3、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨 架。
[0050] 4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/DR5。
[0051] 5、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0052] 序列表的序列2中，自5'末端第1至6位核苷酸为限制性核酸内切酶MluI的识 别序列，第7至第17位核苷酸位Gene end序列，第18位核苷酸为基因间隔序列（IG)，第 19至29位核苷酸为Gene start序列，第30至35位核苷酸为Kozak序列，第36至659位 核苷酸为TRAIL基因区段（TRAIL基因的胞外区），第667至672位核苷酸为限制性核酸内 切酶MluI的识别序列。
[0053] 6、用限制性内切酶MluI单酶切步骤5得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
[0054] 7、用限制性内切酶MluI单酶切重组质粒pBrClone30/DR5,回收约19kb的载体骨 架。
[0055] 8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/ DR5-TRAIL。经测序，重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL的核苷酸序列如序列表的序列3所 示（序列表的序列3中，自5'末端第2703-19872位核苷酸为rClone30/DR5-TRAIL病毒的 基因组）。
[0056] 9、用限制性内切酶MluI单酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨架。
[0057] 10、将步骤6的酶切产物和步骤9的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/ TRAIL。
[0058] 11、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
[0059] 序列表的序列4中，自5'末端第1至6位核苷酸为限制性核酸内切酶Hpa I的 识别序列，第7至第12位核苷酸为Kozak序列，第13至474位核苷酸为IL2基因区段，第 475至480位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。
[0060] 12、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤11得到的双链DNA分子，回收酶切 产物。
[0061] 13、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨 架。
[0062] 14、将步骤12的酶切产物和步骤13的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/ IL2〇
[0063] 二、重组病毒的制备
[0064] 1、将重组质粒 pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N 质粒、pBL-P 质粒和 pBL-L 质粒共转 染BHK-21细胞（每IX IO6个细胞约转染1 μ g重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、0. 5 μ g pBL-N质粒、0· 25 μ gpBL-P质粒和0· 1 μ gpBL-L质粒），置于5% C02、37°C环境中静置培养 72h〇
[0065] 2、取步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于 9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
[0066] 3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C 环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
[0067] 4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37°C 环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
[0068] 5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿 囊液混合，得到混合液。该混合液的HA效价为211，HI效价为29。
[0069] 将步骤5得到的混合液命名为rClone30/DR5-TRAIL病毒液。
[0070] 三、对照病毒的制备
[0071] 用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的1至5,得 到的混合液命名为rClone30病毒液。
[0072] 用重组质粒pBrClone30/DR5代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的 1至5,得到的混合液命名为rClone30/DR5病毒液。
[0073] 用重组质粒pBrClone30/TRAIL代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二 的1至5,得到的混合液命名为rClone30/TRAIL病毒液。
[0074] 用重组质粒pBrClone30/IL2代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的 1至5,得到的混合液命名为rClone30/IL2病毒液。
[0075] 实施例2、重组病毒的鸡胚稳定性检测
[0076] 待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒 液或rClone30/TRAIL病毒液。
[0077] 取100 μ L待须彳病毒液，用灭菌后的PBS缓冲液稀释，然后经由尿囊腔接种至9-11 日龄SPF鸡胚中，37°C孵化72h。收集鸡胚尿囊液，取HA阳性尿囊液接种9-11日龄SPF鸡 胚并进行连续传代。
[0078] 取第1代、第3代、第5代、第8代和第10代鸡胚尿囊液各100 μ L并按Reed-Muench 两氏法计算每毫升病毒液的TCID5。。
[0079] 进行三次重复试验，结果取平均值。
[0080] 结果见表1。结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液和 rClone30/TRAIL病毒液均具有增殖稳定性。
[0081] 表1各代鸡胚尿囊液的HA滴度和TCID50
[0082] CN 105176937 A 说明书 6/10 页
[0083] 实施例3、检测重组病毒感染肿瘤细胞后DR5蛋白的表达
[0084] 待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒 液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。
[0085] 1、取对数生长期的HepG2细胞，以IMOI的剂量感染待测病毒液，37°C静置孵育 48h〇
[0086] 2、完成步骤1后，取细胞，1700r/min离心5min，收集细胞沉淀，用预冷的PBS缓冲 液洗涤两次。
[0087] 3、用PBS缓冲液重悬步骤2得到的细胞沉淀，加入鼠抗人DR5单克隆抗体（一抗） 并冰上孵育40min，然后1700r/min离心5min，收集沉淀，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次。
[0088] 4、用PBS缓冲液重悬步骤3得到的沉淀，加入FITC标记的兔抗鼠（二抗）并冰上 避光孵育40min，然后1700r/min离心5min，收集沉淀。
[0089] 5、用PBS缓冲液重悬步骤4得到的沉淀，利用流式细胞仪进行检测。
[0090] 结果见图1。图1中，A为!fepG2空细胞荧光强度检测结果，B为感染rClone30病 毒液的IfepG2细胞的荧光强度检测结果，C为感染rClone30/TRAIL病毒液的H印G2细胞 的荧光强度检测结果，D为感染rClone30/DR5病毒液的HepG2细胞的荧光强度检测结果， E为感染rClone30/DR5-TR