AIL病毒液的HepG2细胞的荧光强度检测结果。结果表明：与 !fepG2空细胞相比，感染rClone30病毒液、rClone30/TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液 和rClone30/DR5-TRAIL病毒液都能显著上调H印G2细胞表面DR5蛋白的表达水平；与感染 rClone30病毒液相比，感染rClone30/DR5病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液能显著上 调H印G2蛋白表面DR5蛋白的表达水平。
[0091] 实施例4、检测重组病毒感染肿瘤细胞后TRAIL蛋白的表达
[0092] 待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒 液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。
[0093] 1、取对数生长期的HepG2细胞，以IMOI的剂量感染待测病毒液，37°C静置孵育 48h〇
[0094] 2、完成步骤 1 后，取细胞培养上清，采用 Human TRAIL/TNFSF10 Quantikine ELISA kit (DTRL00 ;R&D公司）检测细胞培养上清中TRAIL蛋白的水平。
[0095] 结果见图2。图2中，A为!fepG2空细胞的检测结果，B为感染rClone30病毒液 的HepG2细胞的检测结果；C :感染rClone30/DR5病毒液的HepG2细胞的检测结果；D :感 染rClone30/TRAIL病毒液的!fepG2细胞的检测结果；E :感染rClone30/DR5-TRAIL病毒 液的HepG2细胞的检测结果。结果表明，与HepG2空细胞、感染rClone30病毒液和感染 rClone30/DR5病毒液相比，感染rClone30/TRAIL病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液能 极显著的上调TRAIL蛋白的表达水平。
[0096] 实施例5、检测凋亡相关基因 mRNA表达变化。
[0097] 待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒 液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。
[0098] 1、取对数生长期的HepG2细胞，以IMOI的剂量感染待测病毒液，37°C静置孵育 48h〇
[0099] 2、完成步骤1后，取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
[0100] 3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测DR5基因、TRAIL基 因、caspase3 基因、caspase7 基因和 caspase8 基因（caspase3、caspase7 和 caspase8 均 为凋亡相关因子）的相对表达情况，以β-actin基因为内参基因。
[0101] 用于检测DR5基因的引物对如下：
[0102] 上游引物：5 ' -AGATTCTCCTGAGATGTGCCGGA-3 ' ；
[0103] 下游引物：5 ' -ACCACCTGAGCAGATGCCTTTCAGG-3 '。
[0104] 用于检测TRAIL基因的引物对如下：
[0105] 上游引物：5 ' -TCAGAGAGTAGCAGCTCACATA-3 ' ；
[0106] 下游引物：5 ' -GTTCACCATTCCTCAAGTGCAA-3 '。
[0107] 用于检测caspase3基因的引物对如下：
[0108] 上游引物：5 ' -TCATAAAAGCACTGGAATGACATC-3 ' ；
[0109] 下游引物：5 ' -TTCTGAATGTTTCCCTGAGGTT-3 '。
[0110] 用于检测caspase7基因的引物对如下：
[0111] 上游引物：5 ' -TCTATGTGCCCCGTCAGTA-3 ' ；
[0112] 下游引物：5 ' -ACATCCATACCTGTCGCTTT-3 '。
[0113] 用于检测caspase8基因的引物对如下：
[0114] 上游引物：5 ' -CATTTGCATATTTAGCCGCCAAG-3 ' ；
[0115] 下游引物：5 ' -TTAAGAGTCCCAGGAATTCAGCAAC-3 '。
[0116] 用于检测β-actin基因的引物对如下：
[0117] 上游引物：5 ' -CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3 ' ；
[0118] 下游引物：5 ' -ACCCTCATAGATGGGCACA-3 '。
[0119] DR5基因的相对表达量见图3。结果表明：感染rClone30/DR5病毒液和rClone30/ DR5-TRAIL病毒液使DR5基因的相对表达量增加，与感染rClone30病毒液和感染 rClone30/TRAIL病毒液相比差异极显著。结果表明，插入新城疫病毒载体的外源基因 DR5 可以有效地在肿瘤细胞表达。
[0120] TRAIL基因的相对表达量见图4。结果表明：感染rClone30病毒液和感染 rClone30/DR5病毒液后TRAIL基因几乎不表达；感染rClone30/TRAIL病毒液和rClone30/ DR5-TRAIL病毒液使TRAIL基因的相对表达量增加，与感染rClone30病毒液和rClone30/ DR5病毒液相比差异极显著。结果表明，插入新城疫病毒载体的外源基因 TRAIL可以有效地 在肿瘤细胞内表达。
[0121] caspase3基因、caspase7基因和caspase8基因的相对表达量见图5。结果表明， 感染rClone30/DR5_TRAIL病毒液后可检测到caspase3、caspase7和caspase8基因的高表 达，与感染rClone30病毒液、感染rClone30/DR5病毒液、感染rClone30/TRAIL病毒液相比 差异极显著。
[0122] 实施例6、重组病毒对肿瘤细胞的作用效果
[0123] 待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒 液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。肿瘤细胞为H印G2细胞和U251细胞。
[0124] 一、MTT法检测rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤细胞的抑制作用
[0125] 1、将对数生长期的肿瘤细胞进行胰酶消化，然后用含10%小牛血清的DMEM培养 基制成2 X IO4个细胞/mL的细胞悬液。
[0126] 2、将步骤1得到的细胞悬液接种于96孔板（每孔200微升），置于5 % C02、37°C 环境中静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
[0127] 3、完成步骤2后，取所述96孔板，感染待测病毒液（分别设置如下感染剂量： 0. 1M0I、IMOI或10M0I ;每孔100 μ L病毒液；设置用等体积含5%小牛血清的DMEM培养基 代替病毒液的对照组），置于5% C02、37°C环境中静置培养lh，吸弃培养上清，用PBS缓冲 液洗涤。
[0128] 4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入含10%小牛血清的DMEM培养基，置于 5% C02、37°C环境中静置培养24h、48h或72h。
[0129] 5、完成步骤4后，取所述96孔板，每孔加入20 μ L MTT溶液（5mg/mL)并37°C孵育 4h，吸弃培养上清，每孔加入150 μ L DMS0,震荡混匀lOmin，用酶标仪于测定490nm处的OD 值，计算细胞生长的抑制率。
[0130] 抑制率=(对照处理孔的OD值-试验处理孔的OD值）/对照处理孔的OD值。
[0131] 对H印G2细胞的抑制率见图6。图6中，A对应步骤3中感染不同MOI (分别为 0. 1M0I，1M0I，10M0I)待测病毒液在培养72h的结果，B对应感染同一 MOI (即0. 1M0I)待测 病毒液在不同的培养时间（分别为24h，48h，72h)的结果，C对应感染同一 MOI (即1M0I)待 测病毒液在不同培养时间（分别为24h，48h，72h)的结果，D对应感染同一 MOI (即10M0I) 待测病毒液在不同培养时间（分别为24h，48h，72h)的结果。
[0132] 对U251细胞的抑制率见图7。图7中，A对应步骤3中感染不同MOI (分别为 0. 1M0I，1M0I，10M0I)待测病毒液在培养72h的结果，B对应感染同一 MOI (即0. 1M0I)待测 病毒液在不同的培养时间（分别为24h，48h，72h)的结果，C对应感染同一 MOI (即1M0I)待 测病毒液在不同培养时间（分别为24h，48h，72h)的结果，D对应感染同一 MOI (即10M0I) 待测病毒液在不同培养时间（分别为24h，48h，72h)的结果。
[0133] 结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤细胞的抑制作用显著强于rClone30 病毒、rClone30/DR5病毒和rClone30/TRAIL病毒，抑制率与病毒剂量呈明显的剂量依赖性 关系，且抑制率与时间成正比。
[0134] 二、Annexin V/PI法检测rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤细胞的杀伤效果
[0135] 1、将对数生长期的H印G2细胞进行胰酶消化，然后用含10 %小牛血清的DMEM培养 基制成I X IO4个细胞/mL的细胞悬液。
[0136] 2、将步骤1得到的细胞悬液接种于6孔板（每孔2ml)，置于5% C02、37°C环境中 静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
[0137] 3、完成步骤2后，取所述6孔板，感染待测病毒液（分别设置如下感染剂量：1M0I 或10M0I ;设置用等体