hizobium iaponicum)活化的菌种按体积百分含量 5%的接种量分别接种到装有1批、2批和3批样品不锈钢发酵罐内，然后在温度为30°C、搅 拌速度为l〇〇r/min、空气流量为0. 45v/v/m、罐压为0. lkPa、溶氧为70%、发酵液pH为7. 2 的条件下发酵120h，即得花生液体根瘤菌剂，在无菌条件下分装到伽马线灭菌的双层塑料 袋中，每袋装225mL，备用。其中，v/v/m为发酵行业专有的表示空气流量的单位，0. 45v/v/ m表示每分钟进入发酵罐的空气体积是培养基体积的0. 3倍。
[0097] 本试验通过搅拌速度的变化来达到控制溶氧的目的，当溶氧低于70%时控制系统 自动增加转速，当溶氧高于70%时控制系统自动降低转速。
[0098] 本试验的日本慢生花生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大 学微生物菌种保藏中心，北京圆明园西路2号，保藏编号CCBAUl5464。
[0099] 将第1批、第2批和第3批得到的花生液体根瘤菌剂，每批取20袋在温度为20°C 条件下，分别放置3个月、6个月、9个月和12个月，通过平板计数检测菌数，结果见表4。
[0100] 表4大规模发酵生产花生根瘤菌试验数据
[0102] 由表4可以看出，5吨发酵罐的控制系统更完善，可以为根瘤菌的生长提供更为有 利的环境，活菌数更高。在20°C恒温柜中保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上；由 中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中心对本次试验进行抽样检测的结果为110 亿/ _升°
[0103] 在种子上存活期长短是衡量液体根瘤菌剂产品的另一个重要指标。如果根瘤菌施 到种子上后迅速死亡，等到种子发芽时只有少数菌存活，那么接种根瘤菌的效果会大打折 扣。
[0104] 将本试验得到的花生液体根瘤菌剂与以YMB为培养基，按照本试验的方法制备的 花生液体根瘤菌剂进行对比试验：将本试验得到的花生液体根瘤菌剂与YMB培养的花生液 体根瘤菌剂分别按每千克花生种子接种2. 8毫升根瘤菌剂然后在15°C条件下储存，定期测 定种子上活菌数，结果见表5 ;其中，YMB培养基是最常用的根瘤菌培养基，其组成如下：10 克/升的甘露醇、〇. 5克/升的K2HP04、0. 2克/升的MgS047H20、0. 1克/升的NaCl、0. 5克 /升的酵母粉和 1000 毫升纯水（详见Vincent J.M.1970A manualfor the practical study of root-nodule bacteria. IBP handbook 15. Blackwell Scientific Publications， Oxford.) 〇
[0105] 表5种子上活菌数数据
[0107] 由表5可知，在168小时后，本试验所产根瘤菌剂在种子上的活菌数是YMB所产根 瘤菌的130倍，由此可知，本试验制备得到的花生液体根瘤菌剂营养均衡、菌体活性高、在 种子上存活时间长。
[0108] 最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其 限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进 行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方 案的范围。
【主权项】
1.一种花生根瘤菌培养基，其特征在于：其由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、 〇-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、順4(：1、1(2册0 4、腿2?04、1%304 71120、0&(：1221120、？630 4 7H20、NaCl、Na2MoO4 ? 2H20和生物素配制而成的水溶液，其中，丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李 糖、果糖、a -酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU K2HP04、KH2P04、MgSO4 7H20、CaCl2 2氏0、？6504 71120、似(：1、似2]\1〇04.21120和生物素的质量比为：1~3:1~3:1~3:1~ 3 : 1~3 : 0.5~1.5 : 2.5~4.5 : 0.13~0.25 : 0.1~0.2 : 0.65~1.6 : 1~ 3 : 0.2~0.5 : 0.1~0.3 : 0.1~0.2 : 0.005~0.011 : 0.05~0.15 : 0.01~ 0.03 : 0.0005~0.002,所述的水溶液pH为6. 8~7. 5。2. 根据权利要求1所述的花生根瘤菌培养基，其特征在于：其中，丙三醇、甘露醇、葡萄 糖、鼠李糖、果糖、〇-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、順 4(：1、1(2即04、腿2?04、1^0 4 71120、 CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 ? 2H20 和生物素的质量比为：1. 5 ~2. 5 : 1. 5 ~ 2.5 : 1.5 ~2.5 : 1.5 ~2.5 : 1.5 ~2.5 : 0.75 ~1.25 : 3.0 ~4.0 : 0.15 ~ 0.20 : 0.125 ~0.175 : 0.8 ~1.25 :Ll~1.6 : 0.25 ~0.4 : 0.15 ~0.25 : 0.11 ~ 0.15 : 0.006 ~0.009 : 0.08 ~0.12 : 0.015 ~0.025 : 0.0008 ~0.0012。3. 根据权利要求1所述的花生根瘤菌培养基，其特征在于：其中，丙三醇、甘露醇、葡萄 糖、鼠李糖、果糖、〇-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、順 4(：1、1(2即04、腿2?04、1^0 4 71120、 CaCl2 2H20、FeS04 7H20、NaCl、Na2Mo04.2H20和生物素的质量比为：2.0 : 2.0 : 2.0 : 2.0 : 2 .0 ：I. 0 ： 3. 5 ： 0. 18 ： 0. 15 ：I.I： 1. 2 ： 0. 34 ： 0. 2 ： 0. 13 ： 0. 0083 ： 0. 1 ： 0. 02 ： 0. 001〇4. 一种采用权利要求1所述的花生根瘤菌培养基制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在 于：其包括以下步骤： 51、 按照质量比为：1~3 : 1~3 : 1~3 : 1~3 : 1~3 : 0.5~1.5 : 2.5~ 4.5 : 0.13 ~0.25 : 0.1 ~0.2 : 0.65 ~1.6 : 1~3 : 0.2 ~0.5 : 0.1 ~0.3 : 0.1 ~ 0? 2 : 0? 005 ~0? 011 : 0? 05 ~0? 15 : 0? 01 ~0? 03 : 0? 0005 ~0? 002 的比例称取丙 三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、a-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CUK2HP04、 KH2P04、MgS04 7H20、CaCl2 2H20、FeS04 7H20、NaCl、Na2Mo04.2H20 和生物素，并依次加入到纯 水中混合均匀，调节pH至6. 8~7. 5,得花生根瘤菌培养基； 52、 将Sl得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，121°C高压蒸汽灭菌20min，待培 养基温度降至30°C时，将花生根瘤菌按体积百分含量5%~10%的接种量接种至灭菌的花 生根瘤菌培养基中，在温度为25~35 °C、搅拌速度为50~150r/min、空气流量为0. 3~ 0. 6v/v/m、罐压为0. 05~0. 2kPa、溶氧为60 %~80%、发酵液pH为6. 5~7. 5的条件下， 发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂。5. 根据权利要求4所述的制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在于：S1中称取丙三醇、甘 露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、a-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CUK2HP04、KH2P04、 MgSO4 7H20、CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 ? 2H20 和生物素的质量比为：1. 5 ~ 2.5 :I. 5 ~2.5 :I. 5 ~2.5 :I. 5 ~2.5 :I. 5 ~2.5 : 0.75 ~1.25 : 3.0 ~ 4.0 : 0.15 ~0.20 : 0.125 ~0.175 : 0.8 ~1.25 :Ll~1.6 : 0.25 ~0.4 : 0.15 ~ 0.25 : 0.11 ~0.15 : 0.006 ~0.009 : 0.08 ~0.12 : 0.015 ~0.025 : 0.0008 ~ 0.0012。6. 根据权利要求4所述的制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在于：S1中称取丙三醇、甘 露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、a-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4Cl、K2HP04、KH2P04、MgS04 7H20、CaCl2 2H20、FeS04 7H20、NaCl、Na2Mo04.2H20和生物素的质量比为：2.0 : 2.0 : 2.0 : 2.0 ：2. 0 ：I. 0 ： 3. 5 ： 0.18 ： 0.15 ： 1.1 ： 1. 2 ： 0. 34 ： 0. 2 ： 0.13 ： 0. 0083 ： 0.1 ： 0. 02 ： 0. 001〇7. 根据权利要求4所述的制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在于：S2中的花生根瘤菌 培养基占发酵罐总体积的70 %。8. 根据权利要求4所述的制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在于：S2中所述的温度为 29~31°C、搅拌速度为75~125r/min、空气流量为0. 35~0. 55v/v/m、罐压为0. 075~ 0.181^^、溶氧为65~75%、发酵液口11为6.8~7.3。9. 根据权利要求4所述的制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在于：所述的温度为30°C、 搅拌速度为l〇〇r/min、空气流量为0. 45v/v/m、罐压为0.lkPa、溶氧为70 %、发酵液pH为 7. 2,发酵时间为IOOh。10. 根据权利要求4所述的制备花生根瘤菌剂的方法，其特征在于：S2中所述的花生根 瘤菌为日本慢生根瘤菌。
【专利摘要】本发明提供一种花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法，其涉及根瘤菌培养基以及采用其制备花生根瘤菌剂的方法。本发明解决了现有存在的花生液体根瘤菌剂营养不均衡、菌体活性低和发酵工艺制备的花生根瘤菌在室温下不能稳定存活的问题，本发明的花生根瘤菌培养基是由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4Cl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4？7H2O、CaCl2？2H2O、FeSO4？7H2O、NaCl、Na2MoO4·2H2O和生物素配制而成的水溶液，通过控制发酵罐条件，即得。本发明的菌剂20℃保存12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上。
【IPC分类】C12R1/41, C12N1/20, C05G3/00
【公开号】CN105176878
【申请号】
【发明人】王 琦, 杨国平
【申请人】王 琦
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月13日