一种花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生根瘤菌剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种花生根瘤菌培养基以及采用其制备花生根瘤菌剂的方法。
【背景技术】
[0002] 中国耕地面积占全世界耕地面积的7%，而氮肥用量却占全球总用量的25%，是 世界平均用量的3. 75倍。生产化工合成氮肥将消耗大量的、不可再生的石化原料，如天然 气、石油和煤炭等。随着自然能源有限储量的不断减少，石油天然气的价格将持续攀升，从 而不可避免地拉动化肥价格上涨。化肥工业还是造成环境污染，产生温室气体的重要源头。 化肥在施入田间后会造成土壤板结，降低土地生产潜力。植物对化肥的吸收利用率只有 30 %，这意味着有70 %的氮肥不仅没有滋养作物，而且进入地下水源和空气中，造成饮用水 和空气质量下降，进而危害我们的身体健康。
[0003] 事实上花生生长所需的氮素营养基本上由根瘤菌提供，如果没有根瘤菌的存在， 每亩要施一百多公斤尿素才能满足亩产180公斤花生的氮肥需求。一亩地产180公斤花生， 同时还要产270公斤的秸杆；
[0004] 花生蛋白质含量按40%计算：180Χ0· 4 = 72公斤（蛋白质）
[0005] 秸杆蛋白质含量按10%计算：270Χ0· 1 = 27公斤（蛋白质）
[0006] 一亩地产蛋白质：72+27 = 99公斤
[0007] 蛋白质的氮含量为16%，生产99公斤蛋白质需99 X0. 16 = 15. 84公斤纯氮；
[0008] 15. 84公斤纯氮折合尿素：15. 84 + 0. 46 = 34. 43公斤尿素；
[0009] 考虑到尿素的利用率一般在30%以下，34. 43 + 0. 3 = 115公斤。
[0010] 这就是说，如果没有根瘤菌提供氮肥，每生产180公斤花生需要施115公斤尿素才 能满足氮素需求。所以说花生的氮肥基本上是根瘤菌贡献的。由此可见，根瘤菌的好与坏 对花生的生产至关重要。
[0011] 根瘤菌接种技术之所以在我国未能广泛采用，除了科学知识普及不够，农民对根 瘤菌的作用不甚了解外，最主要原因是根瘤菌产品质量不过关，保质期短。根瘤菌剂的有效 成份是活的根瘤菌，但如果制剂不过关，当产品经过一个长的供应链到达农民手中时往往 只有少量活性根瘤菌，实际应用效果不明显。
[0012] 目前，采用文献公开报道的培养基和常规发酵工艺（主要是用于芽孢杆菌发酵） 的方法生产花生液体根瘤菌剂，存在着营养不平衡、菌体活性低的弊端，而且，目前培养花 生根瘤菌的培养基碳源交单一，虽然大多数培养基能很好地支持根瘤菌生长，菌数可达 30-80亿/毫升，但它们基本上都难以在室温下稳定存活，其常温放置2个月的活菌数仅为 1 ~10%〇
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是为了解决现有存在的花生液体根瘤菌剂营养不均衡、菌体活性低 和发酵工艺制备的花生根瘤菌在室温下不能稳定存活的问题，而提供花生根瘤菌培养基以 及采用其制备花生液体根瘤菌剂的方法。
[0014] 具体地，本发明提供一种花生根瘤菌培养基，其由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李 糖、果糖、α -酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU K2HP04、KH2P04、MgSO4 7H20、CaCl22H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 · 2H20和生物素配制而成的水溶液，其中，丙三醇、甘露醇、 葡萄糖、鼠李糖、果糖、α -酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU K2HP04、KH2P04、MgSO47H20、CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 · 2H20 和生物素的质量比为：1 ~3 : 1 ~ 3 : 1~3 : 1~3 : 1~3 : 0.5~1.5 : 2.5~4.5 : 0.13~0.25 : 0.1~0.2 : 0.65~ 1.6 : 1 ~3 : 0.2 ~0.5 : 0.1 ~0.3 : 0.1 ~0.2 : 0.005 ~0.011 : 0.05 ~ 0.15 : 0.01 ~0.03 : 0.0005 ~0.002,所述的水溶液 pH 为 6. 8 ~7. 5。
[0015] 优选地，其中，丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨 酸、精氨酸、NH4C1、K2HP04、KH2P0 4、MgSO4 7H20、CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 · 2Η20 和生物素的质量比为5~2.5 : L 5~2.5 : L 5~2.5 : L 5~2.5 : L 5~ 2. 5 : 0.75 ~1.25 : 3.0 ~4.0 : 0.15 ~0.20 : 0.125 ~0.175 : 0.8 ~1.25 : 1.1 ~ 1.6 : 0.25 ~0.4 : 0.15 ~0.25 : 0.11 ~0.15 : 0.006 ~0.009 : 0.08 ~ 0.12 : 0.015 ~0.025 : 0.0008 ~0.0012。
[0016] 优选地，其中，丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母粉、丝氨 酸、精氨酸、NH4C1、K2HP04、KH2P0 4、MgSO4 7H20、CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 · 2Η20 和生物素的质量比为：2· 0 : 2· 0 : 2· 0 : 2· 0 : 2· 0 : 1· 0 : 3· 5 : 0· 18 : 0· 15 : I. I : 1· 2 : 0 .34 ： 0. 2 ： 0. 13 ： 0.0083 ： 0. 1 ： 0. 02 ： 0. 001〇
[0017] 优选地，本发明还提供一种采用上述花生根瘤菌培养基制备花生根瘤菌剂的方 法，其包括以下步骤：
[0018] 51、按照质量比为：1~3:1~3:1~3:1~3:1~3:0.5~1.5:2.5~ 4.5 : 0.13 ~0.25 : 0.1 ~0.2 : 0.65 ~1.6 : 1~3 : 0.2 ~0.5 : 0.1 ~0.3 : 0.1 ~ 0· 2 : 0· 005 ~0· 011 : 0· 05 ~0· 15 : 0· 01 ~0· 03 : 0· 0005 ~0· 002 的比例称取丙 三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α -酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU Κ2ΗΡ04、 KH2P04、MgS04 7H20、CaCl2 2H20、FeS04 7H20、NaCl、Na2Mo04.2H20 和生物素，并依次加入到纯 水中混合均匀，调节pH至6. 8~7. 5,得花生根瘤菌培养基；
[0019] S2、将Sl得到的花生根瘤菌培养基加入到发酵罐中，121°C高压蒸汽灭菌20min， 待培养基温度降至30°C时，将花生根瘤菌按体积百分含量5%~10%的接种量接种至灭 菌的花生根瘤菌培养基中，在温度为25~35°C、搅拌速度为50~150r/min、空气流量为 0.3~0.6￥八/111、罐压为0.05~0.21^：)&、溶氧为60%~80%、发酵液卩!1为6.5~7.5的条 件下，发酵72~144h，即得花生液体根瘤菌剂。
[0020] 优选地，Sl中称取丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸、酵母 粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU K2HP04、KH2P04、MgSO4 7H20、CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、 Na2MoO4 ·2Η20和生物素的质量比为：1· 5~2.5 : L 5~2.5 : L 5~2.5 : L 5~ 2.5 : L 5 ~2.5 : 0.75 ~1.25 : 3.0 ~4.0 : 0.15 ~0.20 : 0.125 ~0.175 : 0.8 ~ 1.25 : Ll ~1.6 : 0.25 ~0.4 : 0.15 ~0.25 : 0.11 ~0.15 : 0.006 ~0.009 : 0.08 ~ 0.12 : 0.015 ~0.025 : 0.0008 ~0.0012。
[0021] 优选地，SI中称取丙三醇、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α_酮戊二酸、酵母 粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU K2HP04、KH2P04、MgSO4 7H20、CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、 Na2MoO4CH2O和生物素的质量比为：2.0 : 2.0 : 2.0 : 2.0 : 2.0 : LO : 3.5 : 0.18 : 0.15 :LI : 1.2 : 0.34 : 0.2 : 0.13 : 0.0083 : 0.1 : 0.02 : 0.001ο
[0022] 优选地，S2中的花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%。
[0023] 优选地，S2中所述的温度为29~31°C、搅拌速度为75~125r/min、空气流量为 0.35~0.55￥八/111、罐压为0.075~0.181^^、溶氧为65~75%、发酵液？!1为6.8~7.3。
[0024] 优选地，所述的温度为30°C、搅拌速度为100r/min、空气流量为0. 45v/v/m、罐压 为0. lkPa、溶氧为70 %、发酵液pH为7. 2,发酵时间为IOOh。
[0025] 优选地，S2中所述的花生根瘤菌为日本慢生根瘤菌。
[0026] 本发明具有以下有益效果：
[0027] 本发明采用甘油、甘露醇、葡萄糖、鼠李糖、果糖、α-酮戊二酸等物质组成混合碳 源，来替代常规使用的单一碳源，精确控制碳源、氮源和矿质营养元素的平衡，并用优化的 发酵工艺控制花生根瘤菌的生产过程，制备得到的花生液体根瘤菌剂在20°C恒温柜中保存 12个月活菌数仍然达每毫升100亿以上，中国农业部微生物肥料及食用菌菌种质量检测中 心对本发明的菌剂抽样检测的结果为110亿/毫升，杂菌数为〇。目前我国的农业微生物菌 剂（包括根瘤菌剂）的国家标准为2亿/克活菌数，相比提高了 50倍。国外液体花生根瘤 菌剂最好产品的实测活菌数为50亿左右，保质期为12个月，保证最低活菌数不低于20亿 /毫升。本产品的活菌数高于国外最好产品。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步解释：
[0029] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0030] 一：本实施方式的花生根瘤菌培养基，是由丙三醇、甘露醇、葡萄糖、 鼠李糖、果糖、Ct -酮戊二酸、酵母粉、丝氨酸、精氨酸、NH4CU K2HP04、KH2P04、MgSO4 7H20、 CaCl2 2H20、FeSO4 7H20、NaCl、Na2MoO4 · 2H20和生物素配制而成的水溶液；其中，丙三醇浓 度为1~3克/升、甘露醇浓度为1~3克/升、葡萄糖浓度为1~3克/升、鼠李糖浓度 为1~3克/升、果糖浓度为1~3克/升、α -酮戊二酸浓度为〇. 5~1. 5克/升、酵母粉 浓度为2. 5~4.