一相同。
【具体实施方式】 [0054] 二十：本实施方式与六至十九之一不同的是：S2中所 述的将花生根瘤菌按7%~9%的接种量接种至灭菌的花生液体根瘤菌培养基中。其它与 六至十九之一相同。
【具体实施方式】 [0055] 二^^一 ：本实施方式与六至二十之一不同的是：S2中 所述的将花生根瘤菌按8%的接种量接种至灭菌的花生液体根瘤菌培养基中。其它与具体 实施方式六至二十之一相同。
【具体实施方式】 [0056] 二十二：本实施方式与六至二^^一之一不同的是：S2 中所述的花生根瘤菌为日本慢生根瘤菌。其它与六至二十一之一相同。
[0057] 通过以下试验验证本发明的有益效果：
[0058] 试验 1
[0059] 本试验摇瓶制备花生液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
[0060] 一、按丙三醇的浓度为2. 0克/升、甘露醇的浓度为2. 0克/升、葡萄糖的浓度为 2. 0克/升、鼠李糖的浓度为2. 0克/升、果糖的浓度为2. 0克/升、α -酮戊二酸的浓度 为I. 〇克/升、酵母粉的浓度为3. 5克/升、丝氨酸的浓度为0. 18克/升、精氨酸的浓度为 〇· 15克/升、NH4Cl的浓度为I. 1克/升、1(2即04的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34 克/升、MgSO4 7Η20的浓度为0. 13克/升、CaCl2 2Η20的浓度为0. 13克/升、FeSO4 7Η20的 浓度为〇. 0083克/升、NaCl的浓度为0. 1克/升、Na2MoO4 · 2Η20的浓度为0. 02克/升和 生物素的浓度为〇. 001克/升称取上述物质，并依次加入到IL纯水中混合均匀，调节pH至 7. 2,得花生液体根瘤菌培养基；
[0061] 二、将装有IOOmL花生液体根瘤菌培养基的三个250mL三角瓶，分为摇瓶1、摇瓶 2和摇瓶3 ;向摇瓶1、摇瓶2和摇瓶3中分别接种一环日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)活化的斜面菌种，在温度为30°C、转速为180r/min的条件下振荡培养96h，得 种子液；将5mL种子菌液转至新的摇瓶1、摇瓶2和摇瓶3中，然后在温度为30°C、转速为 180r/min的条件下振荡培养120h，即得花生液体根瘤菌剂。
[0062] 本试验的日本慢生花生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大 学微生物菌种保藏中心，北京圆明园西路2号，保藏编号CCBAUl5464。
[0063] 将摇瓶1、摇瓶2和摇瓶3得到的花生液体根瘤菌剂在温度为20°C条件下，分别放 置3个月、6个月以及9个月，通过平板计数检测菌数，结果见表1。
[0064] 表1摇瓶培养花生根瘤菌试验数据
[0066] *注：由于三角瓶的瓶塞具有透气性，储存过程会有水分损失，每个月补加无菌水 至原体积。
[0067]由表1可知，摇瓶发酵得到的花生液体根瘤菌剂，起始菌数为81. 7亿/mL，在20°C 条件下放置3个月后菌数高于刚培养结束时的菌数，表明根瘤菌在摇瓶中可缓慢增长，随 后菌数就缓慢下降，9个月时活菌数仍有72亿/mL。
[0068]试验 2
[0069] 本试验小试发酵制备花生液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
[0070] -、按丙三醇的浓度为2. 0克/升、甘露醇的浓度为2. 0克/升、葡萄糖的浓度为 2. 0克/升、鼠李糖的浓度为2. 0克/升、果糖的浓度为2. 0克/升、α -酮戊二酸的浓度 为I. 〇克/升、酵母粉的浓度为3. 5克/升、丝氨酸的浓度为0. 18克/升、精氨酸的浓度为 〇· 15克/升、NH4Cl的浓度为I. 1克/升、1(2即04的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34 克/升、MgSO4 7Η20的浓度为0. 13克/升、CaCl2 2Η20的浓度为0. 13克/升、FeSO4 7Η20的 浓度为〇. 0083克/升、NaCl的浓度为0. 1克/升、Na2MoO4 · 2Η20的浓度为0. 02克/升和 生物素的浓度为〇. 001克/升称取上述物质，并依次加入到IL纯水中混合均匀，调节pH至 7. 2,得花生液体根瘤菌培养基；
[0071] 二、将装有花生液体根瘤菌培养基的三个5升台式发酵罐，分为1批、2批和3批样 品；将日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)活化的菌种按体积百分含量5%的接 种量分别接种到装有1批、2批和3批样品发酵罐内，然后在温度为30°C、转速为250r/min、 空气流量为I. 58L/min、发酵液pH为6. 5~7. 5的条件下发酵120h，即得花生液体根瘤菌 剂，在无菌条件下分装到灭菌的三角瓶中，20°C储存备检。
[0072] 本试验的日本慢生花生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大 学微生物菌种保藏中心，北京圆明园西路2号，保藏编号CCBAUl5464。
[0073] 将第1批、第2批和第3批得到的花生液体根瘤菌剂在温度为20°C条件下，分别放 置3个月和6个月，通过平板计数检测菌数，结果见表2。
[0074] 表2小试发酵生产花生根瘤菌试验数据
[0076] *注：由于三角瓶的瓶塞具有透气性，储存过程会有水分损失，每个月补加无菌水 至原体积。
[0077] 由表2可知，小试发酵得到的花生液体根瘤菌剂，起始菌数为115亿/mL，在20°C 条件下放置3个月后菌数高于刚培养结束时的菌数，表明根瘤菌在摇瓶中可缓慢增长，随 后菌数就缓慢下降，6个月时活菌数仍有126亿/mL。
[0078] 而现有的YMB培养基是最常用的根瘤菌培养基，其组成如下：
[0079] 10克/升的甘露醇、0. 5克/升的K2HP04、0. 2克/升的MgS04 7H20、0. 1克/升 的NaCl、0. 5克/升的酵母粉和1000毫升纯水（详见Vincent J. Μ. 1970A manual for the practical study of root-nodule bacteria. IBP handbook 15.Blackwell Scientific Publications，Oxford.)〇
[0080] 采用YMB培养基按照本试验的方法培养日本慢生型花生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)只能获得20~30亿/毫升的菌数，而且在室温下保存2个月后90%的菌死亡， 无法用作大规模生产液体花生根瘤菌剂。由此可知，20°C保存6个月后本试验的方法培养 日本慢生型花生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)与YMB培养基培养相比提高35倍以 上。
[0081] 试验 3
[0082] 本试验中试发酵制备花生液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
[0083] 一、按丙三醇的浓度为2. 0克/升、甘露醇的浓度为2. 0克/升、葡萄糖的浓度为 2. 0克/升、鼠李糖的浓度为2. 0克/升、果糖的浓度为2. 0克/升、α -酮戊二酸的浓度 为1. 〇克/升、酵母粉的浓度为3. 5克/升、丝氨酸的浓度为0. 18克/升、精氨酸的浓度为 〇· 15克/升、NH4Cl的浓度为I. 1克/升、1(2即04的浓度为1.2克/升、KH2PO4的浓度为0.34 克/升、MgSO4 7Η20的浓度为0. 13克/升、CaCl2 2Η20的浓度为0. 13克/升、FeSO4 7Η20的 浓度为〇. 0083克/升、NaCl的浓度为0. 1克/升、Na2MoO4 · 2Η20的浓度为0. 02克/升和 生物素的浓度为〇. 001克/升称取上述物质，并依次加入到IL纯水中混合均匀，调节pH至 7. 2,得花生液体根瘤菌培养基；
[0084] 二、向三个300升304不锈钢发酵罐内加入210升步骤一得到的花生液体根瘤菌 培养基，即花生根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70%;将日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)活化的种子菌液按体积百分含量7. 5 %的接种量分别接种到发酵罐内，然后在 温度为30°C、搅拌速度为100r/min、空气流量为0. 45v/v/m、罐压为0. lkPa、溶氧为70 %、发 酵液PH为7. 2的条件下发酵120h，即得液体花生根瘤菌剂，在无菌条件下分装到伽马线灭 菌的双层塑料袋中，每袋装225mL，备用。其中，v/v/m为发酵行业专有的表示空气流量的单 位，0. 45v/v/m表示每分钟进入发酵罐的空气体积是培养基体积的0. 45倍。
[0085] 本试验通过搅拌速度的变化来达到控制溶氧的目的，当溶氧低于70%时控制系统 自动增加转速，当溶氧高于70%时控制系统自动降低转速。
[0086] 本试验的日本慢生花生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum)，购买自中国农业大 学微生物菌种保藏中心，北京圆明园西路2号，保藏编号CCBAUl5464。
[0087] 将第1批、笫2批和第3批得到的花生液体根瘤菌剂在温度为20°C条件下，分别放 置3个月和6个月，通过平板计数检测活菌数，结果见表3。
[0088] 表3中试发酵罐生产花生根瘤菌试验数据
[0091] *注：根瘤菌液装在密封的塑料袋中，无水分损失。
[0092] 由表3可知，中试发酵得到的花生液体根瘤菌剂，起始菌数为120亿/mL，在20°C 条件下放置3个月后菌数高于刚培养结束时的菌数，表明根瘤菌在塑料袋中可缓慢增长， 随后菌数就缓慢下降，6个月时活菌数仍有87亿/mL。
[0093] 试验 4
[0094] 本试验大规模发酵制备花生液体根瘤菌剂的方法是按以下步骤进行的：
[0095] -、按丙三醇的浓度为2. 0克/升、甘露醇的浓度为2. 0克/升、葡萄糖的浓度为 2. 0克/升、鼠李糖的浓度为2. 0克/升、果糖的浓度为2. 0克/升、α -酮戊二酸的浓度 为1. 〇克/升、酵母粉的浓度为3. 5克/升、丝氨酸的浓度为0. 18克/升、精氨酸的浓度为 〇. 15克/升、NH4Cl的浓度为I. 1克/升、1(2即04的浓度为1.2克/升、狃丨04的浓度为0. 34 克/升、MgSO4 7Η20的浓度为0. 13克/升、CaCl2 2Η20的浓度为0. 13克/升、FeSO4 7Η20的 浓度为〇. 0083克/升、NaCl的浓度为0. 1克/升、Na2MoO4 · 2Η20的浓度为0. 02克/升和 生物素的浓度为〇. 001克/升称取上述物质，并依次加入到IL纯水中混合均匀，调节pH至 7. 2,得花生液体根瘤菌培养基；
[0096] 二、向三个5吨304不锈钢发酵罐内分别加入3. 5吨步骤一得到的花生液体根瘤 菌培养基，即花生液体根瘤菌培养基占发酵罐总体积的70% ;将其分为1批、2批和3批培 养基；然后将1批、2批和3批培养基在121°C温度下高压蒸汽灭菌20min，待培养基温度降 至30°C时，将日本慢生根瘤菌（Bradyr