μ L三氯甲烷混 匀；
[0106] 4. 12000rpm，4°C，离心15min吸上清于新的无酶离心管中；
[0107] 5.加入200 μ L三氯甲烧混勾，12000rpm，4°C，离心15min吸上清于新的无酶离心 管中；
[0108] 6.加入等体积的异丙醇，静置15111；[11，12000印111，4<€，离心15111；[11。弃上清，室温瞭 干；
[0109] 7.加入1ml的70vol %乙醇，12000rpm，4°C，离心15min。用无酶枪头吸去乙醇，室 温放置干燥；
[0110] 8.加入50 μ L无酶水溶解RNA，-80 °C储存；
[0111] 9.浓度测定：取1 μ L RNA用Nanodrop 2000测定浓度；
[0112] 10.变性胶电泳检测RNA完整性：取1 μ g RNA在1. 2%的变性胶中电泳，观察RNA 完整性。
[0113] 取 0· 5-1 μ g 总 RNA 为模板，根据 PrimeScript RT reagent kit (TaKaRa, Otsu, Shiga, Japan)试剂盒说明进行操作，获得重组菌株的cDNA。使用 ABI-Prism 7900 sequence detection system(Applied Biosystems，CA)按照SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems, CA)的说明进行 RT-qPCR 反应。反应体系为：10 μ I SYBR Green PCRMaster Mix，两种引物各0· 5 μ 1，8 μ 1无酶水，1 μ 1模板。PCR循环设置为 50°C 2min，95°C 10min，95°C 15s，60°C 30s，40 个循环。18SrDNA 作为内参基因，各转化子取 三个平行。
[0114] 结果如图 3 所示，M. alpina 为野生型对照；MA-G3PDl-l，MA-G3PDl-2，MA-G3PDl-3， MA-G3PD1-4, MA-G3PD1-5为重组菌株，5株基因工程菌G3TO1的转录量均明显高于对照菌 株，提高2倍左右，其中MA-G3PD1-1表达量为M. alpina野生型对照2. 3倍，说明通过使用 根癌土壤杆菌介导转化高山被孢霉的方法可以明显提高3-磷酸甘油脱氢酶基因的转录。
[0115] 实施例4阳性转化子中3-磷酸甘油脱氢酶活性测定
[0116] 取0. 2g菌体用液氮充分研磨至粉末，加入2mL酶提取缓冲液（含有IOOmM磷酸二 氢钾/氢氧化钾缓冲液（PH7. 5)，ImM苯甲脒盐酸，ImM二硫苏糖醇和20wt %甘油），转移到 I. 5mL离心管中，4°C，10000g，离心5min，吸取上清液到新的I. 5mL离心管中即粗蛋白提取 液。
[0117] 3-磷酸甘油脱氢酶活性测定反应体系各组分浓度为：20mM咪唑盐酸缓冲液 (pH7. 0)，ImM氯化镁，0. 09mM还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0. 67mM磷酸二羟丙酮，粗蛋白 约 0. lmg/mL。
[0118] 测定方法：迅速混匀除磷酸二羟丙酮外的其他试剂，30°C保温2min ;340nm处测定 3min，待数值基本稳定后，加入磷酸二轻丙酮，于340nm处测定3min，根据单位时间内吸光 值的变化计算酶活。3-磷酸甘油脱氢酶酶活以每mg蛋白每分钟产物的增加量或底物的减 少量表示。
[0119] 结果如图 4所示。M. alpina为野生型对照；MA-G3PDl-l，MA-G3PDl-2，MA-G3PDl-3， MA-G3PD1-4, MA-G3PD1-5为重组菌株，5株基因工程菌3-磷酸甘油脱氢酶活性均明显高于 对照菌株，均提高2倍左右，说明过表达G3PD1提高了 3-磷酸甘油脱氢酶的活性。
[0120] 结果表明，本发明获得的高山被孢霉过表达3-磷酸甘油脱氢酶工程菌株经过多 次传代后，G3PD1片段仍稳定存在基因组中，且脂肪酸分析结果显示所得到的基因工程菌株 中脂质产量均有明显提高，挑选脂质产量提高达50 %的菌株MA-G3PD1-1保藏为本发明的 高山被孢霉GPD-1，用此方法构建的基因工程菌株及构建方法为后续工业化奠定了理论及 应用基础。
[0121] 虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉 此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护 范围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一株过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组高山被孢霉菌株（Mortierellaalpina) GPD-1，该菌株于2015年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11001。2. 根据权利要求1所述的重组高山被孢霉菌株，其特征在于所述菌株是以含3-磷酸甘 油脱氢酶基因的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。3. 根据权利要求1所述的重组高山被孢霉菌株，其特征在于该菌株是用含有3-磷酸 甘油脱氢酶基因的重组质粒pBIG2-ura5S-G3PDl转化根癌土壤杆菌后，再以含转化质粒 pBIG2-ura5s-G3PDl的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。4. 构建权利要求1或2所述的重组高山被孢霉菌株的方法，包括以下步骤： a) 克隆来源于Mortierella alpinaATCC#32222的3-磷酸甘油脱氢酶基因G3PD1 ; b) 构建重组质粒pBIG2-ura5s-G3PDl; c) 用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-G3PDl转化根癌土壤杆菌； d) 用含重组质粒pBIG2-ura5s-G3PDl的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺 陷型菌株； e) 筛选鉴定转化菌株，获得过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组高山被孢霉菌株。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤a)中，用于扩增3-磷酸甘油脱氢酶基 因G3F*D1的引物序列如下： Pl (sense) ：CGGGGTACCCCATGTCTGAAAAAGTAGCACTAATCG P2 (antisense) ：TCCCCCCGGGTTAGATATCCTCGACAATCCTGATG6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤c)的根癌土壤杆菌为根癌土壤杆 ISf(Agrobacterium tumefaciens)C58C1〇7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤d)的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷 型菌株是重组高山被孢霉（Mortierellaalpina)MAU1，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 8414。8. 根据权利要求4所述的构建重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于所述步骤e)中 筛选鉴定转化菌株的方法包括以下步骤： 1) 用3mL生理盐水冲刷GY表面，收集液体于一个无菌I. 5mL离心管中。过25ym滤 膜； 2) 用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度IO8个每100yL、10 6个每100yL、10 4 个每100yL，各取200yL涂布于含有100yg/mL壮观霉素，100yg/mL头孢噻肟的GY-CS 平板上，25 °C避光培养2-3天； 3) 随时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝于含有100yg/mL壮观霉素，100yg/mL头孢 噻肟的SC-CS平板上，25 °C培养2-3天； 4) 观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于GY斜 面上； 5) 将上述步骤4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次； 6) 将稳定遗传的菌株鉴定为过表达G3TO1基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY斜面 上； 7) 提取含有G3PD1基因的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，设计一对与启动子和终 止子特异性结合的引物进行PCR验证： P3 (sense) ：CACACACAAACCTCTCTCCCACT P4(antisense) ：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC； 8) 所述重组菌株保藏于GY斜面上。9.权利要求1-4中任一项权利要求所述的过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组高山 被孢霉菌株GPD-I或根据权利要求4-8中任一项权利要求所述的方法得到的重组高山被孢 霉在生产脂肪酸中的用途。
【专利摘要】本发明涉及一株过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因G3PD1的重组高山被孢霉GPD-1及其构建方法。本发明通过尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉MAU1为材料，运用根癌土壤杆菌介导，得到了一株脂质含量明显提高的过表达3-磷酸甘油脱氢酶(G3PD1)基因的重组菌株。与野生型高山被孢霉相比，本发明的菌株的总脂含量野生型高山被孢霉提高约50％，其G3PD1的转录量提高约2倍，为后续工业化应用奠定了理论及应用基础。CGMCC No. 1100120150702
【IPC分类】C12N15/53, C12P7/64, C12N1/15, C12N15/63
【公开号】CN105176848
【申请号】
【发明人】陈海琴, 陈永泉, 陈卫, 杨华, 郝光飞, 王鸿超, 杨芹, 顾震南, 张灏
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月19日