一株过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的高山被孢霉、其构建方法及应用
【专利说明】一株过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的高山被孢霉、其构建 方法及应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种在高山被孢霉中过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的工程菌株及其 构建方法，属于生物工程技术领域。 【【背景技术】】
[0002] 多不饱和脂肪酸（PUFAs)是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为16-26的直 链脂肪酸。PUFAs是人体所必需的脂肪酸，对人类和动物的营养与健康具有十分重要的意 义，具有调节血脂，清理血栓，调节免疫功能，健脑补脑等作用。由于传统的PUFAs来源已经 无法满足日益增长的市场需求，所以能够积累多不饱和脂肪酸的微生物日渐成为食品、医 药、化工和养殖领域研究的热点。高山被孢霉（Mortierellaalpina，M. alpina)是一种工业 化生产花生四稀酸（Arachidonic acid，ARA)的产油真菌，可以以甘油三酯形式积累多种多 不饱和脂肪酸，已经通过美国农业部（FDA)的安全性评估，同时也是脂质生物化学基础研 究的重要模式菌。
[0003] 甘油三酯是脂质积累的主要形式，其合成主要遵循kennedy途径：游离脂肪酸首 先被活化形成脂酰辅酶A，随后在不同酶的催化作用下与3-磷酸甘油进行酯化反应生成甘 油一酯，进而合成甘油二酯，最终合成甘油三酯并结合蛋白形成脂肪颗粒。可见，3-磷酸 甘油作为合成甘油三酯的骨架，有可能对产油微生物的脂质积累具有重要的意义。以往对 于产油微生物脂质积累的研究多集中于脂肪酸的合成途径，期待通过过表达这些途径中的 基因（例如乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合成酶）以增加脂质产量，而有关3-磷酸甘油对 甘油三酯合成影响的研究没有大规模深入展开，3-磷酸甘油脱氢酶是广泛存在于微生物、 动植物细胞中的一类代谢调控酶，有多种同工酶形式，分别参与能量代谢、磷脂合成以及细 胞内氧化还原反应的调节。NAD+依赖型的3-磷酸甘油脱氢酶可催化磷酸二羟丙酮生成 3_磷酸甘油，是甘油合成途径中的关键酶。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中存 在两种NAD+依赖型3-磷酸甘油脱氢酶同工酶（G3PD1和G3TO2):-种参与渗透压的调节； 另一种与厌氧环境下的能量代谢有关。Nguyen等研究者发现在酿酒酵母中过表达G3TO1 使3-磷酸甘油脱氢酶的活性提高了 4倍左右，并导致菌株中3-磷酸甘油的含量升高了 20 倍，但是其脂肪酸含量与野生型没有区别，这就意味着3-磷酸甘油并没有影响到酿酒酵母 的甘三酯积累。但是，随后的研究发现，将酿酒酵母的3-磷酸甘油脱氢酶基因在欧洲油菜 (Brassica napus)中表达，两倍酶活性的提高直接导致油菜种子的3-磷酸甘油含量提高 了 3~4倍，最终使油菜种子脂质产量提高了 40%，这表明在种子中，3-磷酸甘油能调控甘 三酯的合成。此外，在耶氏解脂酵母中过表达自身的G3PD1后，甘油三酯总量也有所提高。 所以，3-磷酸甘油很有可能在脂质合成过程中发挥着重要的作用，提高细胞内3-磷酸甘油 的供给将有助于提高产油真菌的脂质产量。
[0004] 高山被孢霉中存在3-磷酸甘油脱氢酶同工酶，通过转录组数据分析，选取在脂 质代谢中发生明显变化的G3PD1基因为研究对象，以中国专利申请CN 201310347934.8 中公开的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株MUl为宿主菌株，以中国专利申请号CN 201310524221. 4中公开的高山被孢霉（Ealpina)重组基因表达系统为基础，通过根癌土 壤杆菌介导的方法过表达G3PD1基因，使得重组菌株具有高产脂质的能力，对于产油真菌 高山被孢霉的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的是通过根癌土壤杆菌介导的方法提供一株过表达G3PD1基因的重 组高山被孢霉工程菌株，以及在高山被孢霉（Malpina)中过表达G3PD1基因的方法。本发 明的另一个目的是提供一株含有质粒pBIG2-ura5s-G3PDl的根癌土壤杆菌。本发明的再一 个目的是将所述重组高山被孢霉工程菌株用于工业生产油脂。
[0006] -方面，本发明提供了一株过表达G3PD1基因的高山被孢霉工程菌株，该菌株是 以含G3PD1基因的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
[0007] 特别地，该高山被孢霉工程菌株是用含有3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组质粒 pBIG2_ura5s_G3PDl转化根癌土壤杆菌后，再以含转化质粒pBIG2_ura5s_G3PDl的根癌土 壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
[0008] 在本发明中，重组质粒pBIG2-ura5s-G3PDl的构建可参考中国专利申请 CN201310524221.4中公开的内容。根据该申请的记载，首先用PCR的方法从pD4质粒上 获得HPH表达单元，将HPH表达单元用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和 XbaI酶切过的pET28a (+)的多克隆位点（MCS)中，得到质粒pET28a-HPHs。利用PCR从 高山被孢霉cDNA中获得ura5(乳清酸磷酸核糖转移酶；OPRTase)基因，并利用限制性内 切酶BspHI和BamHI酶切ura5基因，将酶切过的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切过 的质粒pET28a-HPHs中，以替换的hpt基因，构建质粒pET28a-ura5s。用限制性内切酶 EcoRI和XbaI酶切质粒pET28a_ura5s得到ura5s表达单元。将ura5s表达单元替换质 粒PBIG2RHPH2中的HPH表达单元，进一步构建质粒转化质粒pBIG2-ura5s。更进一步地在 质粒pBIG2-ura5s和质粒pET28a-HPHs的基础上，构建高山被孢霉基因操作通用载体。用 PCR的方法从高山被孢霉基因组中获得非编码的内含子DNA片段IT。用限制性内切酶NcoI 和BamHI分别对IT基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将IT片段取 代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质粒pET28a-ITs。用限制性内切酶SpeI和XbaI 双酶切质粒pET28a_ITs得到ITs表达单元。将ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒 pBIG2-ura5s中，得到高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs。然后通过基因工程 技术将3-磷酸甘油脱氢酶基因插入高山被孢霉通用载体pBIG2-ura5s-ITs中，构建二元表 达载体 pBIG2-ura5s-G3PDl 〇
[0009] 在本发明中，所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是已公开的重组高山被孢霉 MAU1，其保藏编号为CGMCCNo. 8414,该菌株已在中国专利申请CN 201310347934. 8中公开。 在本发明中，重组高山被孢霉MAUl (CGMCCNo. 8414)被命名为重组高山被孢霉CCFM501，为 同一株工程菌株。
[0010] 根据CN 201310347934. 8说明书记载，重组高山被孢霉MAUl是通过失活高山被孢 霉（Mortierellaalpine)ATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5 基因构建而成的。其中，ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp 共18bp的序列而实现的，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp 和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为：首先获得ura5敲除基因片段，并进一 步构建敲除质粒pBIG4KOura5,然后用重组质粒pBIG4KOura5转化根癌土壤杆菌，最后用经 转化的含质粒pBIG4KOura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进 行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉MAUl菌株。
[0011] 另一方面，本发明提供了一种构建过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组 高山被孢霉菌株的方法，该方法包括如下步骤：克隆来源于高山被孢霉（M. alpina) ATCC#32222的3-磷酸甘油脱氢酶基因，然后通过基因工程技术将其插入高山被孢霉通 用载体pBIG2_ura5s_ITs中，构建二元表达载体pBIG2_ura5s_G3PDl，再用含重组质粒 pBIG2-ura5s-G3PDl的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株CCFM501，通过筛 选和鉴定，获得过表达3-磷酸甘油脱氢酶的高山被孢霉工程菌株。
[0012] 在本发明中，应用于转化高山被孢霉的根癌土壤杆菌为：根癌土壤 杆菌 Agrobacterium tumefaciens C58C1(Tsuji G,Fujii S,Fujihara N,et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J]. Journal of General Plant Pathology, 2003, 69(4) :230-239.)，为本领域技术人员可以公开获得的菌株。
[0013] 本发明以中国发明专利申请CN 201310347934. 8公开的高山被孢霉尿嘧啶 营养缺陷型菌株MAUl(CGMCCNo. 8414)作为转化宿主菌株，以中国发明专利申请CN 201310524221. 4公开的高山被孢霉重组基因表