达系统为基础，在其基础上通过进一步的基 因重组方法构建一株新的能够高表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组高山被孢霉菌株。
[0014] 本发明所涉及的Broth培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，lg/L 磷酸二氢钾，〇. 25g/L七水硫酸镁，10g/L硝酸钾，余量为水，pH6. 0。
[0015] 本发明所涉及的MM固体培养基，其组成为：1. 74g/L磷酸氢二钾，I. 37g/L磷酸二 氢钾，0. 146g/L氯化钠，0. 49g/L七水硫酸镁，0. 078g/L氯化钙，0. 0025g/L七水硫酸亚铁， 0. 53g/L硫酸铵，I. 8g/L葡萄糖，0. 5wt%甘油，20g/L琼脂，余量为水，pH6. 8。
[0016] 本发明所涉及的頂培养基是在MM培养基的基础上添加了 200 μΜ的乙酰丁香酮 (AS)构成的。
[0017] 本发明所涉及的SC-CS培养基是添加了浓度为100 μ g/mL壮观霉素奇霉素 (spectinomycin)和浓度为100 μ g/mL头抱噻月亏抗生素（CefotaximeSodium)的SC固体培 养基。SC固体培养基组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，I. 7g/L硫 酸铵，60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mg/L苏氨酸，40mg/L赖氨酸， 30mg/L酪氨酸，20mg/L腺噪呤，20mg/L精氨酸，20mg/L组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼 月旨，余量为水，PH6.8。
[0018] 本发明所涉及的GY-CS培养基是添加了浓度为100 μ g/mL壮观霉素奇霉素 (spectinomycin)和浓度为100 μ g/mL头抱噻月亏抗生素（CefotaximeSodium)的GY固体培 养基。GY固体培养基组成为：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸钾，lg/L磷酸二 氢钠，3g/L七水硫酸镁，20g/L琼脂，余量为水，pH6. 8。
[0019] 本发明在现有的高山被孢霉转化系统的基础上，采用根癌土壤杆菌介导的基因转 化方法，构建了在高山被孢霉中过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因（G3PD1)的工程菌株高山被 孢霉GPD-I。获得的基因工程菌株经过多次传代，G3PD1片段仍稳定存在基因组中，且生长 特性与原养型菌株无明显差别，但总脂产量相对于原始菌株提高了 50%左右，这为该基因 工程菌株工业化生产油脂提供了基础。
[0020] 本发明的重组高山被孢霉菌株（Mortierellaalpina)GPD-I于2015年7月2日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11001
[0021] 高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株（Mortierellaalpina)MAUl于2013年11月01 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCCNo. 8414。 【【附图说明】】
[0022] 图1为二元表达载体pBIG2-ura5s-G3PDl的构建示意图；
[0023] 图2为过表达G3PD1基因的高山被孢霉重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
[0024] 其中，M为marker，N为高山被孢霉野生型对照菌株，1、2、3、4、5分别为 pBIG2-ura5s-G3PDl 转化的重组菌株：MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2, MA-G3PD1-3, MA-G3PD1-4， MA-G3PD1-5 ；
[0025] 图3为高山被孢霉野生型菌株与5株基因工程菌株3-磷酸甘油脱氢酶基因 (G3roi)RT_qPCR的结果分析图；
[0026] 其中，M. alpina 为野生型对照；MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2, MA-G3PD1-3， MA-G3PD1-4, MA-G3PD1-5 为重组菌株。
[0027] 图4为高山被孢霉野生型菌株与5株基因工程菌株3-磷酸甘油脱氢酶活性的测 定结果分析图；
[0028] 其中，M. alpina 为野生型对照；MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2, MA-G3PD1-3， MA-G3PD1-4, MA-G3PD1-5 为重组菌株。 【【具体实施方式】】
[0029] 以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
[0030] 实施例1过表达3-磷酸甘油脱氢酶基因的重组高山被孢霉菌株的构建
[0031] 一、高山被孢霉G3PD1的克隆
[0032] 根据高山被孢霉（M. alpina)ATCC#32222G3PDl 基因（GeneBankKT344118)的序列 信息，设计引物PI、P2,下划线部分分别为酶切位点KpnI和Xmal，以高山被孢霉CDNA为模 板，用引物P1/P2、KOD高保真聚合酶，通过PCR对G3PD1基因进行扩增，得到目的片段。
[0033] PCR 程序为：94°C 3min，94°C 30s，58°C 30s，68°C I. 5min，30 个循环，68°C 5min ;得 到PCR产物，再对PCR产物进行纯化，纯化产物用I. 2%的琼脂糖凝胶电泳验证。
[0034] Pl(sense) ：CGGGGTACCCCATGTCTGAAAAAGTAGCACTAATCG
[0035] P2 (antisense) ：TCCCCCCGGGTTAGATATCCTCGACAATCCTGATG
[0036] 二、二元表达载体的构建
[0037] L酶切反应
[0038] 在37°C条件下，先用限制性内切酶KpnI过夜酶切步骤（一）的PCR纯化产物及载 体 pBIG2-ura5s-ITs。KpnI 酶切体系（IOOyL)为：2yLKpnI-HF，30yL 质粒或 PCR 产物， 10以1^(：111：1]1&1^131^€61'，58 4 1^去离子水，37°(^水浴酶切1211。
[0039] 其中，载体pBIG2-ura5s-Its是中国专利申请CN20131052422L 4中已经公开的内 容。
[0040] 酶切产物回收纯化后，再用内切酶XmaI单酶切，酶切体系为（100 μ L) :2 μ LXmal， 30 μ L质粒或PCR产物，10 μ L cutmartBuffer，58 μ L去离子水，37°C水浴酶切12h。
[0041 ] 本发明涉及的内切酶缓冲液cutsmart buffer :50mM乙酸钾（Potassium acetate)，20mM(Tris-乙酸）Tris-acetate，IOmM 乙酸儀（Magnesium acetate)，100 μ g/ml BSA，余量为水，ρΗ7·9。
[0042] 2.连接反应
[0043] 用Τ4连接酶将酶切纯化后的片段G3PD1与载体pBIG2-ura5s-ITs连接，4°C连接 12h，得到重组表达载体为pBIG2-ura5s-G3PDl。连接体系为（IOyL) :2yL目的基因酶切 后片段，3 μ L载体酶切后片段，1 μ L连接酶buffer，1 μ L T4连接酶，3 μ L无菌水，4°C连接 12h〇
[0044] 连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，转化方法如下：
[0045] ⑴无菌状态下取100 μ L感受态细胞，加入1-2 μ L连接产物，吹吸混匀。
[0046] ⑵将混匀的感受态细胞移入预冷过的电转杯中，避免产生气泡。
[0047] ⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，电转。电压条件为 1. 8kv〇
[0048] ⑷加入1ml SOC复苏培养基于电转后的感受态细胞中，混匀转移至I. 5ml离心管 中，37°C，150rpm孵育1小时。
[0049] (5)取200 μ L涂布含有100 μ g/mL卡那霉素的LB固体培养基平板。倒置37 °C培养 过夜。
[0050] 挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体 pBIG2-ura5s-G3PDl。
[0051] 其中，SOC复苏培养基的组成为：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，0. 5g/L氯化钠， 2. 5mM氯化钾，IOmM氯化镁，20mM葡萄糖，余量为水；LB固体培养基的组成是：10g/L胰蛋白 胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，余量为水。
[0052] 二元表达载体pBIG2-ura5s_G3PDl电击转化根癌土壤杆菌的方法参照转化大肠 杆菌T0P10的方法，得到含有质粒pBIG2-ura5s-G3PDl的根癌土壤杆菌C58C1。
[0053] 三、根癌土壤杆菌介导转化高山被孢霉MAUl (即高山被孢霉CCFM501)
[0054] 在已有的国内外文献有关根癌土壤杆菌转化方法报道的基础上，做了适当的优化 调整，具体如下：
[0055] ⑴将保存于_80°C的含有质粒pBIG2-ura5s-G3PDl的根癌土壤杆菌C58C1在含有 100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板上划线。28°C倒置避光培 养48小时；
[0056] ⑵挑取单克