隆接种至20mL含有100 μ g/mL利福平和100 μ g/mL卡那霉素的液体 YEP培养基中28 °C，200rpm避光培养24-48小时；
[0057] ⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清。加5mL IM培养基重悬菌体，4000g离心 5分钟，倒掉上清。加2mL頂培养基重悬菌体；
[0058] ⑷用頂培养基调整菌浓度至0D600为0. 3。置于28°C，200rpm摇床避光培养至 0D600 到 I. 0 ;
[0059] (5)用500 μ L灭菌的生理盐水冲刷在GY-U斜面培养1个月以上的高山被孢霉尿嘧 啶营养缺陷型菌株CCFM501 (申请号为201310347934. 8的专利申请中公开的Μ. alpina尿 嘧啶营养缺陷型菌株），收集孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到IO7个每100 μ L ;
[0060] (6)取100 μ L根癌土壤杆菌与100 μ L孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的頂固体 培养基上。23°C避光培养36-48小时；
[0061] (7)将玻璃纸转移到含有100 μ g/mL壮观霉素和100 μ g/mL头孢噻肟抗生素的SC 平板（SC-CS)上。18°C避光培养12h，随后转移至25°C培养；
[0062] ⑶持续观察菌落在SC-CS平板上的生长情况，若长出明显菌落，及时用尖头镊子 将菌落外沿挖出（大约2mm2)，接种于SC-CS平板上，继续正置于25°C培养箱中培养；
[0063] (9)待SC-CS平板上的转化子长出后，挑菌丝转接于SC-CS平板，重复筛选3次，排 除阴性转化子；
[0064] (1Φ将筛选3次后生长的菌落接种至GY平板，28°C培养至产生大量孢子，保藏在 4Γ。
[0065] 其中，MM培养基成分是：1. 74g/L磷酸氢二钾，I. 37g/L磷酸二氢钾，0· 146g/L氯 化钠，0. 49g/L七水硫酸镁，0. 078g/L氯化钙，0. 0025g/L七水硫酸亚铁，0. 53g/L硫酸铵， I. 8g/L葡萄糖，0· 5wt%甘油，ρΗ6· 8,余量为水。
[0066] 頂培养基是在MM培养基的基础上添加了 200 μ M的乙酰丁香酮（AS)构成的。
[0067] SC培养基的组分是：5g/L酵母氮源（无氨基酸与硫酸铵），I. 7g/L硫酸铵，20g/L 葡萄糖，20mg/L腺噪呤，30mg/L络氨酸，lmg/L甲硫氨酸，2mg/L组氨酸，4mg/L赖氨酸，4mg/ L色氨酸，5mg/L苏氨酸，6mg/L异亮氨酸，6mg/L亮氨酸，6mg/L苯丙氨酸，2mg/L精氨酸，余 量为水。
[0068] GY固体培养基的组分是：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸钾，lg/L磷 酸二氢钠，3g/L七水硫酸镁，20g/L琼脂，余量为水。
[0069] YEP培养基的组分是：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，余量为水。 涉及到固体培养基时添加20g/L琼脂。
[0070] 四、高山被孢霉过表达G3PD1工程菌株筛选和鉴定
[0071] 1)用3mL生理盐水冲刷GY表面，收集液体于一个无菌I. 5mL离心管中，过25 μm 滤膜；
[0072] 2)用血球计数器计数，调整为三种孢子浓度梯度IO8个每IOOyUlO 6个每 100 μ L、IO4个每100 μ L，分别取200 μ L涂布于含有100 μ g/mL壮观霉素和100 μ g/mL头 孢噻肟的GY-CS平板上，25 °C避光培养2-3天；
[0073] 3)随时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝SC-CS平板上，25°C培养2-3天；
[0074] 4)观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在SC-CS平板上生长的菌丝接种于 GY斜面上；
[0075] 5)将上述步骤4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在GY斜面上传代三次；
[0076] 6)将稳定遗传的菌株鉴定为过表达G3PD1基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于GY 斜面上；
[0077] 7)提取鉴定正确的重组高山被孢霉菌株的基因组DNA，用一对与启动子和终止子 特异性结合的引物进行PCR验证：
[0078] P3(sense) ：CACACACAAACCTCTCTCCCACT
[0079] P4(antisense) ：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC ；
[0080] 重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2, M为marker，N为高山被孢霉野 生型对照，1、2、3、4、5 :MA-G3PD1-1，MA-G3PD1-2, MA-G3PD1-3, MA-G3PD1-4, MA-G3PD1-5 为 pBIG2-ura5s-G3PDl转化的重组菌株，可扩增出两条大小分别为818bp和1187bp的产物条 带，电泳结果说明二元表达载体成功整合到高山被孢霉基因组中，其中MA-G3PD1-1即为本 发明的高山被孢霉（Mortierellaalpina) GPD-1 〇
[0081 ] 8)所述重组菌株保藏于GY斜面上。
[0082] 实施例2高山被孢霉脂肪酸提取与检测
[0083] ⑴将高山被孢霉原养型菌株与实施例1筛选获得的高山被孢霉过表达G3PD1基 因的工程菌株MA-G3PD1-1(即本发明的高山被孢霉GPD-1)，MA-G3PD1-2, MA-G3PD1-3， MA-G3PD1-4 和 MA-G3PD1-5 接种于 broth 培养基中，28°C，200r/min 摇床培养 7 天；
[0084] ⑵收集菌体，真空冷冻干燥至恒重，称量菌体重量，计算生物量；
[0085] ⑶将菌体研磨成粉末，称取50mg，加入2mL 4mol/L盐酸；
[0086] ⑷80 °C水浴Ih，-80 °C放置15分钟。重复一次。80 °C水浴Ih ;
[0087] (5)冷却至室温，加入ImL甲醇，混匀；
[0088] (6伽入ImL氯仿，震荡lOmin。6000g离心3min。收集氯仿；
[0089] (7)重复(6俩次；
[0090] ⑶合并氯仿（3mL)，加入ImL饱和氯化钠，混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿层于 新瓶。剩余液体继续加入ImL氯仿，3000g离心3分钟。合并氯仿（4mL);
[0091] (9)氮吹干燥，加入ImL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥。
[0092] 脂肪酸组成及含量的测定方法：①向上述粗脂中分别加入100 μ L 2. 02mg/ml内 标C15:0的正己烧和ImL 10wt%盐酸的甲醇，60°C水浴3h，每隔30min振荡Imin ;②冷却 至室温后加入ImL正己烧和ImL饱和NaCl溶液，震荡混勾，3000rpm离心3min，吸出正己 烧层，再加入ImL正己烧，震荡混勾，3000rpm离心3min，吸出并合并正己烧；③37°C氮气 吹干后，加入ImL正己烷，混匀，转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；④脂肪酸甲酯分析采用 GC-2010 (Shimadzu Co.，Japan)，色谱柱为 DB-Waxetr (30mX 0· 32mm，0· 22 μ m)。氢火焰离子 检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240°C和260°C，分流方式进样1 μ L，分流比10:1， 载气为氮气。程序升温：初始温度120°C保持3min，以5°C /min升到190°C，再以4°C /min升 至|J220°C，保持20min。通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品（37种脂肪酸甲酯混标，Supelco， USA)和加入内标C15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，其中总脂肪酸含量 用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。
[0093] 表1高山被孢霉野生型菌株与五株基因工程菌株脂肪酸产量的比较
[0094] CN 105176848 A 说明书 8/10 页
[0095] 表1结果显示各转化子的产脂率相比野生型高山被孢霉产量有明显提高，其中 MA-G3PD1-1 (高山被孢霉GPD-1)的总脂含量由野生型的27. 71wt%提高到42. 74wt%，提高 了 50%左右。各转化子总脂含量的差异可能是由G3PD1基因整合到高山被孢霉染色体的位 点不同造成的。
[0096] 实施例3阳性转化子中G3PD1转录水平的RT-qPCR检测
[0097] 根据G3TO1序列和内参18SrDNA序列设计引物：
[0098] P5(sense) ：TACGCCAACCTTCAGAGTCAA
[0099] P6 (antisense) ：TGAGACCATCAACCAATCCACC
[0100] P7 (sense) ：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAG
[0101] P8 (antisense) ：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT
[0102] 高山被孢霉总RNA提取：
[0103] I.取出适量在液氮中冻存的菌体，于预冷的无菌无酶研钵中加入液氮充分研磨；
[0104] 2.加入 ImL TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)继续研磨至粉末，室温放置 至溶解；
[0105] 3.用无酶枪头吸取ImL上述步骤中液体于无酶离心管中，加入200