(NH4)2SO^浓度为20mmol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0100]脱盐层析
[0101](9)用含有0.06mol/L NaCl的浓度为10mmol/L、pH值为6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对Sephadex G_25coarse脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后将收集的蛋白液进行除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
[0102]所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.2 %。
【主权项】
1.一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:其具体步骤为: 未和层析 (1)用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗； (2)用pH值3.0?4.5的平衡缓冲液对步骤(I)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活； 阴离子交换层析 (3)用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗； (4)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液； 阳离子交换层析 (5)用含盐的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行平衡； (6)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液； 疏水作用层析 (7)用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤￠)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行平衡； (8)用含0.35?0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液； 脱盐层析 (9)用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。2.—种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:其具体步骤为: (1)用含lmol/LNaCl的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含lmol/LNaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗； (2)用pH值3.0?4.5的平衡缓冲液对步骤(I)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活； 阴离子交换层析 (3)用含lmol/LNaCl的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗； (4)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液； 阳离子交换层析 (5)用含lmol/LNaCl的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡； (6)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液； 疏水作用层析 (7)用含0.9mOl/L(NH4)2S0j9平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤￠)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含0.9mol/L(NH4)2SOd^平衡缓冲液进行平衡； (8)用含0.35?0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液； 脱盐层析 (9)用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。3.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤⑴、(3)至(9)中所述的平衡缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10?40mmol/L，pH值为5.5?8.0。4.根据权利要求3所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤(5)至(6)中所述平衡缓冲液的pH值为5.5?6.5，步骤(7)至⑶中所述平衡缓冲液的PH值为6.5?7.5。5.根据权利要求1所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤(I)、(3)至(9)中所述的盐选自Na2SO4, NaCl或(NH4)2SO406.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤⑵中所述的pH值3.0?4.5的平衡缓冲液选自醋酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10?40mmol/L。7.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤(2)中所述的病毒灭活采用浓度为0.1?lmol/L的磷酸或柠檬酸调节pH值至3.0?4.0进行病毒灭活。8.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤(I)、(2)中所述的亲和层析，其介质选自rProteinA Fast Flow、Mabselect 或 Mabselect Sure。9.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤(5)、(6)中所述的阳离子交换层析，其介质选自SP Sepharose FastFlow、CM Sepharose Fast Flow 或 CaptoS010.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，其特征在于:步骤(7)、(8)中所述的疏水作用层析，其介质选自Phenyl Sepharsoe6Fast Flow、Butyl Sepharose 4B 或 Butyl Sepharose 4Fast Flow。
【专利摘要】本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，属于生物技术领域，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，即将含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、脱盐层析得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白。本发明具有成本低、目的蛋白纯度高、工艺过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。
【IPC分类】C07K1/18, C07K19/00, C07K1/16, C07K1/22, C07K1/20
【公开号】CN105175548
【申请号】
【发明人】孙丽霞, 陈俊良, 孙波, 邢婷婷, 贾国栋, 朱鹏飞, 王庆民, 郑焕兰, 丁仁志, 石干
【申请人】齐鲁制药有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月13日