滤浓缩得到高纯度的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白原液。
[0033]本发明的优选技术方案之一为:
[0034](I)用含lmol/L NaCl的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含lmol/L NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗；
[0035](2)用pH值3.0?4.5的平衡缓冲液对步骤⑴处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；
[0036]阴离子交换层析
[0037](3)用含lmol/L NaCl的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；
[0038](4)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0039]阳离子交换层析
[0040](5)用含lmol/L NaCl的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含NaCl的平衡缓冲液进行平衡；
[0041](6)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0042]疏水作用层析
[0043](7)用含0.9mol/L (NH4) 2S04的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含0.9mol/L (NH4)2SOd^平衡缓冲液进行平衡；
[0044](8)用含0.35?0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0045]脱盐层析
[0046](9)用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
[0047]本发明所获得的目的蛋白原液采用SEC-HPLC方法检测，纯度可以达到99.2%以上。
[0048]综上所述，本发明首先采用亲和层析捕获重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白，同时除去少量杂质蛋白，然后利用阴离子交换层析、阳离子交换层析去除其中的碱性电荷异构体、少量聚体、色素和微量残留，达到初步纯化的目的，然后选择疏水作用层析进一步去除其中的聚体、色素和微量残留，达到精纯化的目的，最后脱盐层析去除工艺中的高浓度盐，五个层析过程依次作用，相互补充，最终制得高质量的产品，经检测，本发明制备的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的SEC-HPLC分子筛纯度为99.2%以上。本发明的一个特点是在步骤(3)、(4)、(6)、(8)、(9)的冲洗和洗脱时采用了不同范围的低浓度盐((0.6mol/L)，有利于除去碱性电荷异构体、杂质蛋白等，并且本发明所述的制备工艺具有快速、简便、规模易放大，适合大规模生产等特点。
【附图说明】
[0049]图1为SEC-HPLC液相分析实施例1纯化后的重组人血管内皮生长因子受体_抗体融合蛋白的纯度图谱，纯度为99.5 %。
【具体实施方式】
[0050]以下通过实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应作为本发明的限制。
[0051]本发明的方法包括顺序使用含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清澄清过滤，亲和层析，阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水层析、脱盐层析来纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白。本发明中所述的层析介质均可市场购买获得，例如阴离子交换层析柱Q Sephrose Fast Flow(5.0X30cm)，购自GE公司。
[0052]实施例1
[0053]—种纯化重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的方法，其具体步骤为:
[0054]亲和层析
[0055](I)用 100mL 含有 lmol/L NaCl 的浓度为 10mmol/L、pH 值为 7.5 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对rProteinA Fast Flow亲和层析柱(5.0 X 20cm)进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含有lmol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行冲洗，再用浓度为20mmol/L、pH值为6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行冲洗；
[0056](2)用浓度为20mmol/L、pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对步骤(I)处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后用浓度为lmol/L的磷酸调节pH值至4.0进行病毒灭活；
[0057]阴离子交换层析
[0058](3)用 1200mL 含有 lmol/L NaCl 的浓度为 20mmol/L、pH 值为 7.5 的 Tris-HCl 平衡缓冲液对阴离子交换层析柱Q Sephrose Fast Flow(5.0X30cm)进行预平衡，再用浓度为20mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为20mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗，再用含有0.06mol/L NaCl的浓度为10mmol/L、pH值为7.5的Tris-HCl平衡缓冲液进行冲洗；
[0059](4)用含有 0.2mol/L NaCl 的浓度为 10mmol/L、pH 值为 7.5 的 Tris-HCl 平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0060]阳离子交换层析
[0061](5)用200mL含有lmol/L NaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液对SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析柱(2.6X20cm)进行预平衡，再用浓度为20mmol/L、pH值为6.5的柠檬酸-柠檬酸钠平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用浓度为20mmol/L、pH值为6.5的梓檬酸-梓檬酸钠平衡缓冲液进行平衡；
[0062](6)用含有0.15mol/L NaCl的浓度为20mmol/L、pH值为6.5的梓檬酸-梓檬酸钠平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0063]疏水作用层析
[0064](7)用 250mL 含有 0.9mol/L (NH4) #04的浓度为 20mmol/L、pH 值为 7.5 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液对Butyl Sepharose 4Fast Flow疏水层析柱进行平衡，将步骤(6)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含有0.QmoVL(NH4)2SOj^浓度为20mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡缓冲液进行平衡；
[0065](8)用含有0.5mol/L (NH4) #04的浓度为20mmol/L、pH值为7.0的磷酸氢二钠_磷酸二氢钠平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0066]脱盐层析
[0067](9)用含有0.04mol/L NaCl的浓度