重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002]血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)通过与特异性受体-血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)结合刺激新生血管的形成。在肿瘤生长过程中，VEGFs数量激增，与血管生成抑制因子之间的调节失衡，极大地促进了内皮细胞的分裂增殖和迀移，提高血管通透性，为肿瘤的生长和转移提供良好的微环境。
[0003]重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白(VEGF-Trap)是重组融合蛋白，包含人VEGFR特异性结构域VEGFR-1的第二结构域、VEGFR-2的第三结构域以及IgGl的Fe部分。VEGF-Trap是特异性拮抗剂结合并抑制血液中及血管外的游离的VEGF及P1GF。VEGF-Trap可用于治疗老年黄斑变性(AMD)等眼内血管疾病及肿瘤。目前国外已上市重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白为Afliberc印t，商品名分别为EYLEA及ZALTRAP，分别用于治疗老年黄斑变性(AMD)及肿瘤。
[0004]重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白属于融合蛋白，结构较为复杂，其二硫键和糖基化位点较多，其中含有较多的碱性电荷异构体，给下游纯化工作带来很大困难。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种适宜规模化扩大生产的、快速、高效的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白(VEGF-Trap)的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。
[0006]本发明将含有重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白上清依次经过亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、疏水作用层析、脱盐层析及除病毒纳滤得到高质量的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白原液。
[0007]本发明的技术方案如下，具体步骤为:
[0008]亲和层析
[0009](I)用含盐的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡，将重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于亲和层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗；
[0010](2)用pH值3.0?4.5的平衡缓冲液对步骤⑴处理的亲和层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液，然后进行病毒灭活；
[0011]阴离子交换层析
[0012](3)用含盐的平衡缓冲液对阴离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(2)中病毒灭活后的蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阴离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行冲洗，再用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液进行冲洗；
[0013](4)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(3)处理的阴离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阴离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0014]阳离子交换层析
[0015](5)用含盐的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行预平衡，再用不含盐的平衡缓冲液进行平衡，将步骤(4)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于阳离子交换层析介质上，上样结束后继续用不含盐的平衡缓冲液进行平衡；
[0016](6)用含0.1?0.2mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(5)处理的阳离子交换层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从阳离子交换层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0017]疏水作用层析
[0018](7)用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤￠)中收集的洗脱蛋白液进行上样，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白吸附于疏水层析介质上，上样结束后继续用含盐的平衡缓冲液进行平衡；
[0019](8)用含0.35?0.6mol/L盐的平衡缓冲液对步骤(7)处理的疏水层析柱进行洗脱，使重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白从疏水层析柱上洗脱下来，收集洗脱蛋白液；
[0020]脱盐层析
[0021](9)用含0.02?0.06mol/L盐的平衡缓冲液对脱盐层析柱进行平衡，将步骤(8)中收集的洗脱蛋白液上样到脱盐层析柱进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，然后经过除病毒纳滤即获得目的蛋白原液。
[0022]本发明所采用的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白的细胞培养上清在纯化之前先进行澄清过滤，除去细胞培养液中的菌体等成分。
[0023]本发明各个步骤所用的平衡缓冲液为本领域常用的缓冲体系，具有成本低等特点，本发明对各个步骤所用平衡缓冲液的浓度和PH值进行了合理的设计，结合其它条件，达到了很好的纯化效果。步骤(1)、(3)至(9)所用的平衡缓冲液选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10?40mmol/L，pH值为
5.5 ?8.00
[0024]优选地，本发明步骤(5)至(6)中所述平衡缓冲液的pH值为5.5?6.5，步骤(7)至⑶中所述平衡缓冲液的PH值为6.5?7.5。
[0025]根据本发明的技术方案，步骤(I)、(3)至(9)中所述的盐选自Na2S04、NaCl,(NH4)2SO4;优选地，步骤⑴、(3)至(6)、(9)中所述的盐优选为NaCl ;步骤(7)、⑶中所述的盐优选为(NH4) 2S04。
[0026]在步骤⑴至(2)的亲和层析过程中，亲和层析介质选自rProteinA Fast Flow、Mabselect或Mabselect Sure，该过程主要用于捕获细胞培养液中的重组人血管内皮生长因子受体-抗体融合蛋白，同时除去少量杂质蛋白，上样和冲洗结束后采用PH值3.0?4.5的平衡缓冲液对其进行洗脱，所用的PH值3.0?4.5的平衡缓冲液选自醋酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为10?40mmol/L。
[0027]为了去除其中可能潜在的病毒，本发明步骤(2)中采用浓度为0.1?lmol/L的磷酸或柠檬酸调节PH值至3.0?4.0进行病毒灭活。
[0028]为了去除含有的喊性蛋白异构体及少量宿主蛋白、DNA、蛋白A残留、色素等，对未和层析后获得的蛋白液进一步进行步骤(3)至(4)的阴离子交换层析，阴离子交换层析介质选自 Q Sephrose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、Capto Q，该步骤中通过添加盐来增加离子强度，所用的盐选自Na2SO4S NaCl，优选NaCl，冲洗时添加的盐浓度为0.02?0.06mol/L，洗脱时添加的盐浓度为0.1?0.2mol/L0
[0029]为了去除剩余的碱性电荷异构体、聚体及少量宿主蛋白、DNA残留等，对阴离子交换层析后获得的洗脱蛋白液进一步进行步骤(5)至￠)的阳离子交换层析，阳离子交换层析介质选自 SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow或Capto S，该步骤中的平衡缓冲液PH值优选5.5?6.5，该步骤中通过添加盐来增加离子强度，所用的盐选自Na2SO4或NaCl，优选NaCl，洗脱时添加的盐浓度为0.1?0.2mol/L。
[0030]虽然经过上述层析，其中的色素、杂质蛋白得到了去除，但是为了保证最终产品的质量，本发明采用步骤(7)至(8)的疏水作用层析进一步去除其中的聚体、少量的色素、碱性电荷异构体以及微量残留，疏水作用层析介质选自Phenyl Sepharsoe 6Fast Flow、Butyl Sepharose4B或Butyl Sepharose 4Fast Flow，该步骤中的平衡缓冲液pH值优选6.5?7.5，该步骤中通过添加盐来增加离子强度，所用的盐选自(NH4) 2S04、Na2SO4S NaCl，优选(NH4)2SO4，洗脱时添加的盐浓度为0.35?0.6mol/L0
[0031]为了去除疏水层析后蛋白液中的高浓度盐，本发明最后采用步骤(9)的脱盐层析进行缓冲液置换，所用的层析介质为Sephadex G_25Fine或Sephadex G_25Medium或Sephadex G_25coarse，该步骤中平衡时添加的盐选自Na2SO4S NaCl，优选NaCl，浓度为0.02 ?0.06mol/Lo
[0032]为了进一步去除其中可能潜在的病毒，脱盐后进行除病毒纳滤及超