r>[0025]优选地,上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中,所述步骤(2)中的所述P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)中的BEMA:DEA:BMA:铜盐:铜盐配体的摩尔比为1:10-500:10-500:0.1-10:0.1-1O0
[0026]优选地,上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中,所述步骤(3)中的所述缩合剂选自DCC、EDC、DIC中的一种或多种。
[0027]优选地,上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中,所述步骤(3)中的所述催化剂选自吡啶、二甲氨基吡啶、三乙胺和羟基苯并三氮唑中的一种或多种。
[0028]优选地,上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中,所述步骤(3)中的所述 P (OEGMA-CO-BSMA)-g-p (DEA-CO-BMA)中的 BSMA:NHS-OH:BUF:缩合剂:催化剂:cRGD 的摩尔比为 I:0.01-0.1:0.1-0.99:1-10:0.01-0.5:0.01-0.1。
[0029]第三方面,本发明提供了一种上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的纳米制剂,其特征在于,其中的纳米粒子的粒径为10?2000nm,包含的所述靶向前药为P(0EGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)。其中,以 P (OEGMA-co-RGD)为亲水壳层,以 BUF 和P (DEA-co-BMA)为疏水核。
[0030]本发明所述的纳米制剂可在机械搅拌、超声、高压均质机作用下制得,其粒径在10?2000nm,表面光滑、均匀度好、颗粒规则无粘连、再分散性好、载药率和包封率高;其可用于制备静脉或肌肉注射或口服给药的缓释纳米粒,作为肿瘤靶向给药。制备的纳米制剂可以分散在固体、半固体或溶液中。优选的是制成注射给药的药物制剂形式,尤其是供静脉注射用。
[0031 ] 优选地,所述纳米制剂为纳米粒溶液,其中,所述P (OEGMA-co-BUF-co-R⑶)-g-P (DEA-co-BMA)的浓度为 0.001_30g/L,所述 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)经过人体内代谢后,释放的活性药物BUF的摩尔浓度为0.001-10000 μmol/Lo
[0032]第四方面,本发明提供了一种上述纳米粒溶液的制备方法,其特征在于,选自以下方法中的一种:复乳法,薄膜乳化法,乳化蒸发法,界面沉淀法,自组装法。其中,所用到的有机溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙醇和二甲亚砜等各种适合于制备纳米粒溶液的有机溶剂。
[0033]优选地,所述制备方法为复乳法,包括步骤:取4mg P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)溶于200 μ L 二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合溶剂中,超声乳化(10s χ4),再加入2.2mL浓度为1%的pluronic F68水分散介质中,再次超声乳化(10s χ 4)。然后室温下搅拌0.5-5h除去有机相,即得纳米粒溶液。
[0034]优选地,所述制备方法为薄膜乳化法,包括步骤:取4mg P (OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA)溶于400 μ L丙酮溶剂中,旋转蒸发成膜,随后加入4mL的水溶液,室温下搅拌0.5-6h,即得纳米粒溶液。
[0035]优选地,所述制备方法为乳化蒸发法,包括步骤:取4mg P (OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA)溶于400 μ L丙酮/ 二氯甲烷的混合溶剂中,加入到2.2mL浓度为2 %的含聚乙烯醇(PVA)的水分散介质中,超声或高压乳匀乳化,乳液在室温下搅拌2-4h,挥尽有机溶剂,即得纳米粒溶液。
[0036]优选地,所述制备方法为界面沉淀法,包括步骤:取4mg P (OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA)溶于400 μ L丙酮溶剂中,在不断的搅拌条件下,将上述溶液注入2.2mL的浓度为2%的PVA水分散介质中,加压挥发去除丙酮,即得纳米粒溶液。
[0037]优选地,所述制备方法为自组装法,包括步骤:取4mg P (OEGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA)溶于200 μ L DMSO中,将溶液滴入2mL搅拌着的水中,之后将溶液装入透析袋中透析3-72小时,除去有机溶剂,即得纳米粒溶液。
[0038]进一步优选地,所述的纳米粒溶液的制备方法,其特征在于,所述水分散介质选自右旋糖昔40-70、pluronic F68或聚乙稀醇PVA中的一种或多种,并且所述水分散介质的质量体积百分浓度为0.01-10%。
[0039]进一步优选地,所述的纳米粒溶液的制备方法,其特征在于,所述超声的强度为1-1OOOffo
[0040]进一步优选地,所述的纳米粒溶液的制备方法,其特征在于,所述透析袋的截留分子量的范围为1000-10000Da。
[0041 ] 优选地,所述纳米制剂为纳米冻干剂,其中,冻干支架剂选自海藻糖、葡萄糖、乳糖、煎糖、右旋糖苷、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇中的一种或多种,且所述冻干支架剂的质量百分浓度为0.01-20%。
[0042]本发明所述的各种制备方法简便,适于大规模生产,特别适用于制备具有长循环、可生物降解、缓释、被动靶向、主动靶向、运送活性物质、抗肿瘤的药物,尤其是制备抗肠癌的药物。采用本发明的方法获得的抗肿瘤的前药及其纳米制剂适合于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服或经皮给药等方式。
[0043]本发明所述的具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药纳米制剂,可在较低剂量条件下有效地杀伤癌细胞,其对多种癌细胞的杀伤效果明显优于自由蟾毒灵药物。
[0044]本发明所述的制备方法简便,适于大规模生产,特别适应于制备具有长循环、可生物降解、缓释、被动靶向、主动靶向、运送活性物质、抗肿瘤的药物,尤其是制备抗肠癌的药物。采用本发明的方法获得的抗肿瘤的药物适合于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服或经皮给药等方式。
【附图说明】
[0045]图1 为本发明所述的肿瘤靶向前药 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BM A)的一个优选实施例的合成路线图;
[0046]图2为本发明所述的一个优选实施例中的P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BM A)在CDCl3中的1H NMR图谱;
[0047]图3为本发明所述的一个优选实施例中的P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) _g_P (DEA-co-BMA)在 CDCl3中的 1H NMR 图谱;
[0048]图4为本发明所述的一个优选实施例中的P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)的纳米粒子的粒径分布图;
[0049]图5为本发明所述的一个优选实施例中的P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)的纳米粒子对LoVo细胞株作用48小时后的细胞存活率图。
【具体实施方式】
[0050]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施方式。
[0051]第一方面,本发明提供了一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药,其为P(0EGMA-co-BUF-co-RGD)-g-P (DEA-co-BMA)。其中,POEGMA为具有长循环功效的水溶性高分子,BUF为具有抗肿瘤活性的化疗药物蟾毒灵,cRGD为能够有效主动靶向肿瘤组织的多肽,P (DEA-co-BMA)为具有内涵体逃逸功能的高分子。
[0052]第二方面,本发明提供了一种上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法,其合成路线见附图1,具体包括以下步骤:
[0053](I)制备中间产物 P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA):
[0054]将一定量可逆加成断裂链转移引发剂BPTPA,寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯OE GMA,含β -硫代羧基的单体BSMA,含有原子转移自由基引发剂的单体ΒΕΜΑ,溶剂和自由基引发剂加入玻璃管中,真空冻融三次后封管;之后,在20-80°C条件下反应0.5-40小时,得粗产物P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA),最后将该粗产物 P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)纯化处理得所述 P(OEGMA-co-BSMA-co-B EMA)。
[0055](2)制备中间产物 P (OEGMA-co-BSMA)-g-P (DEA-co-BMA):
[0056]将一定量P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)、DEA、BMA、溶剂和铜盐配体加入玻璃管中,真空冻融三次后加入铜盐,再真空冻融两次,然后封管;之后,在20-80°C条件下反应0.5-20小时,得粗产物P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA);最后将该粗产物P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA)过硅胶柱除去铜盐,浓缩,再经纯化处理得所述P (0EGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA)。(3)制备目标产物 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA):
[0057]将一定量P (OEGMA-co-BSMA) -g_P (DEA-co-BMA)、NHS-0H、BUF、缩合剂和催化剂溶于有机溶剂中室温搅拌3-72小时;然后,加入一定量cRGD继续反应1-48小时,得粗产物P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA);最后将该粗产物 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P(DEA-co-BMA)纯化处理得所述 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)。
[0058]在一个优选实施例中,上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中,所述纯化处理为:水中透析,然