一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药及其纳米制剂和制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤靶向递送与缓释给药系统技术领域，尤其涉及一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药，该前药的制备方法，及该前药的纳米制剂和该纳米制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症发病率呈逐年上升趋势，目前已成为威胁人类健康最严重的疾病之一(Siegel R.L.et al, 2015, CA Cancer J Clin, 2015, 65:5-29) 0 化学药物治疗作为手术及放疗之外一种重要的治疗手段在全世界范围内得到广泛应用。但是，大多数化疗药物(如阿霉素、紫杉醇、喜树碱等)存在水溶性差、不可控释放、生物利用度低和毒副作用大等严重缺点。而一种新型抗癌药物的研制常具有风险大、投资大和开周期长等不利因素。因此，如何针对现有抗癌药物的不足，设计、开发新剂型以改进现有剂型的不足逐渐成为生物医学领域研究的重要前沿和热点之一。基于聚合物胶束的纳米药物制备方法多样、化学修饰简单，在抗癌药的新剂型开发、应用方面展现出日益强大的技术优势。
[0003]现有纳米药物通常采用物理包埋、吸附或共价改性的方式将抗肿瘤药物制备成纳米药物，并在其表面进一步化学修饰肿瘤靶向分子以促进其在肿瘤组织附近富集进而达到提高疗效的目的。一系列基于胶束纳米粒子、脂质体、无机纳米粒子(金纳米粒子、量子点、石墨烯、碳纳米管等)以及有机/无机杂化纳米粒子的纳米药物被开发出来(如 Langer et al., Nat Nanotechnol.，2007，2(12):751-60 ;Chen et al., Adv.Mater.2014，65(1): 104-120)。值得指出的是绝大多数纳米药物以细胞内吞的方式进入细胞并在内涵体/溶酶体内释放药物。遗憾的是，药物需要从内涵体/溶酶体中逃逸出来才能发挥抗肿瘤作用；而现有纳米药物体系通常并不具备良好的内涵体逃逸能力，这常常导致进入细胞的药物在溶酶体中被降解掉，不能充分发挥其药效。
[0004]为了更有效地将药物运输到细胞质中发挥作用，研究人员采用病毒、蛋白质、多肽、小分子化合物、光敏剂以及合成高分子等多种方式来打破内涵体/溶酶体的膜屏障。其中，合成高分子由于其精确的可设计性、可规模化制备以及良好的内涵体逃逸能力受到广泛关注。近期，Stayton等将嵌段共聚物聚(N，N-二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯)_b_ (N，N-二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯-Co-甲基丙烯酸正丁酯)，即PDMAEMA-b-P(DEA-co-BMA)用于基因传输(B1materials, 2012, 33, 2301-2309) 0 实验结果表明，P (DEA-co-BMA)嵌段在BMA含量为30-40%时表现出强的内涵体逃逸能力。可能的原因是P(DEA-co-BMA)嵌段在内涵体/溶酶体的酸性环境(pH?5)中DEA由去质子化转变为质子化，导致这种pH敏感胶束的解离，进而促使BMA基元的丁基与膜的磷酯双分子层相互作用破坏了内涵体的膜。最终使得纳米粒子从内涵体/溶酶体中逃逸出来。Liu等进而合成了具有内涵体逃逸功能的嵌段共聚物，聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)-b-(N，N-二乙基氨乙基甲基丙烯酸酯-C0-甲基丙烯酸正丁酯)，即PDMA-b-P (DEA-co-BMA)，并在其两个嵌段上分别标记上pH敏感的荧光染料和PH不敏感的内标分子。所得新型聚合物基pH荧光探针具有良好的内涵体逃逸功能并可灵敏地实时监测细胞质中pH变化过程(Liu et al., B1macromolecules, 2014, 15(11):4293-301)。
[0005]缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酸环肽，简称cRGD，是一种有效的革巴向肽，众多实验已经证实其对肿瘤血管具有很好的革G向效果(James et al., Adv DrugDeliver Rev, 2008, 60:1615-1626)。倘能将cRGD与响应性药物纳米粒相结合，构建对肿瘤组织具有良好特异性靶向功能的纳米药物，发明人相信其将会对改善药物疗效有一定的促进作用。
【发明内容】
[0006]针对现有技术中存在的种种不足，申请人旨在提供一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向药物。
[0007]在本发明中，发明人通过可控聚合手段得到含有P(DEA-co-BMA)和聚寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(POEGMA)聚合物链、具有内涵体逃逸功能的刷形共聚物，并采用酯酶响应性
硫代酯键将抗肿瘤药物蟾毒灵(BUF)共价连接到该聚合物上，采用稳定的酰胺键将对肿瘤新生血管具有特异性靶向功能的cRGD连接到该聚合物上，最后制备成具有内涵体逃逸功能的肿瘤革G向前药及其纳米制剂。其中，由于POEGMA的长链能使纳米载体有效的逃逸网状内皮系统的吞噬，从而达到长循环的目的。由于硫代键在酯酶作用下可以迅速水解释放BUF原药，使其发挥药效，可以有效避免普通化学键改性药物造成的药物活性大幅度下降的问题。在高分子链上共价连接靶向肽cRGD促进其在肿瘤组织部位富集以提高药物的生物利用度。同时，P (DEA-co-BMA)的引入，可以使得进入细胞内内涵体/溶酶体的纳米药物及时从中逃逸出来进入细胞质发挥药效，可有效避免内涵体/溶酶体内强酸和强降解能力的酶对药物分子的降解，提高药物利用率。
[0008]因此，第一方面，本发明提供了一种具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药，其为P(OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)。其中，POEGMA为具有长循环功效的水溶性高分子，BUF为具有抗肿瘤活性的化疗药物蟾毒灵，cRGD为能够有效主动靶向肿瘤组织的多肽，P (DEA-co-BMA)为具有内涵体逃逸功能的高分子。
[0009]为了制备上述P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)，本发明所要解决的另一个技术问题在于如何有效的将内涵体逃逸功能的P(DEA-co-BMA)、靶向肽cRGD和抗肿瘤药物BUF整合到同一聚合物上，使之既能克服BUF水溶性差，生物利用度低问题又能够有效避免传统物理包埋的方法CPT在体内运输过程中的早释问题。同时，又能有效促使进入细胞内的纳米药物从内涵体/溶酶体中逃逸出来避免被降解，并真正发挥作用，从而最大限度地发挥药物疗效。
[0010]第二方面，本发明提供了一种上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法，包括以下步骤:
[0011](I)制备中间产物 P(OEGMA-co-BSMA-co-BEMA):
[0012]将一定量可逆加成断裂链转移引发剂BPTPA，寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯OE GMA，含β -硫代羧基的单体BSMA，含有原子转移自由基引发剂的单体ΒΕΜΑ，溶剂和自由基引发剂加入玻璃管中，真空冻融三次后封管；之后，在20-80°C条件下反应0.5-40小时，得粗产物P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)，最后将该粗产物 P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)纯化处理得所述 P(OEGMA-co-BSMA-co-B EMA)。
[0013](2)制备中间产物 P (OEGMA-co-BSMA)-g-P (DEA-co-BMA):
[0014]将一定量P (OEGMA-co-BSMA-co-BEMA)、DEA、BMA、溶剂和铜盐配体加入玻璃管中，真空冻融三次后加入铜盐，再真空冻融两次，然后封管；之后，在20-80°C条件下反应0.5-20小时，得粗产物P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA);最后将该粗产物P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA)过硅胶柱除去铜盐，浓缩，再经纯化处理得所述P (0EGMA-co-BSMA)-g-P(DEA-co-BMA)。
[0015](3)制备目标产物 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA):
[0016]将一定量P (OEGMA-co-BSMA) -g-P (DEA-co-BMA)、NHS-0H、BUF、缩合剂和催化剂溶于有机溶剂中室温搅拌3-72小时；然后，加入一定量cRGD继续反应1-48小时，得粗产物P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA);最后将该粗产物 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P(DEA-co-BMA)纯化处理得所述 P (OEGMA-co-BUF-co-RGD) -g-P (DEA-co-BMA)。
[0017]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述纯化处理为:水中透析，然后冷冻干燥。
[0018]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(I)中的所述OEGMA的分子量为100-50000。
[0019]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(I)中的所述溶剂选自DMF、DMS0、NMP、异丙醇、甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种。
[0020]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(I)中的所述自由基引发剂选自过氧化环己酮、过氧化二苯甲酰、叔丁基过氧化氢、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈中的一种或多种。
[0021]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(I)中的所述引发剂BPTPA:OEGMA:BSMA:BEMA:自由基引发剂的摩尔比为1:10-200:0.5-200:
0.5-200:0.0l-10
[0022]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(2)中的所述溶剂选自DMF、DMSO, NMP、异丙醇、甲醇、乙醇和四氢呋喃中的一种或多种。
[0023]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(2)中的所述铜盐配体选自联吡啶、PMDETA和Me6TREN中的一种或多种。
[0024]优选地，上述具有内涵体逃逸功能的肿瘤靶向前药的制备方法中，所述步骤(2)中的所述铜盐选自溴化亚铜、氯化亚铜、溴化铜和氯化铜中的一种或多种。