胞上测试NotI限制性消化缓冲液，并且通过在37°C下最多2小时的孵育，细胞是有活力的。NotI消化效率高。文库在4°C下结合细胞I小时后，洗涤细胞并用NotI缓冲液在37°C下消化I小时，然后旋降细胞，收集上清液(含有结合的VH DNA)以进行PCR扩增(图1)。
[0051]第二种方法是使用磷脂酶C(PLC)消化从活细胞剪切掉VH结合剂。该方法使得能够洗脱结合到任意GPI锚定膜蛋白的表位(S卩，表位亚集)的VH。如使用对照分子在FACS上所验证的，PLC剪切效率高。在文库与细胞在40C下孵育I小时后，洗涤细胞并用PLC在37 °C下孵育15分钟。随后旋降细胞，并PCR扩增含有与GPI锚定膜蛋白的细胞外域复合的融合VH的上清液(参见图2)。
[0052]C.对靶和相关/不期望细胞类型的平行选择、差异选择和靶细胞选择性选择
[0053]根据W02010/011944(其通过引用全文并入本文)中所述方案产生主天然融合文库。对于第一轮选择，纯化的融合文库均等地分割成对于所有选择分支具有相同多样性的多个文库(参见图5)。
[0054]依照标准细胞生物学方案，从正常供体或患者获得的原代细胞新鲜解冻或从细胞培养瓶分离。然后细胞在37 0C下在完全培养基中恢复I小时，接着在冰上在选择缓冲液中封闭30分钟。所有选择都在冰上进行以防止抗体和靶内化。
[0055]对于平行选择，文库在室温下使用200ul预封闭链霉抗生物素蛋白珠和200ul预封闭hlgG-环氧化物珠按顺序预清理30分钟以除去任何错误折叠和粘性的文库成员。预清理的文库然后在冰上冷冻并经受预封闭细胞，并在冰上孵育I小时。
[0056]对于靶细胞选择性选择，在冰上对不期望且紧密相关的细胞类型进行I小时预清理以除去任何非选择性的结合剂，然后经受靶细胞处理。
[0057]在第4轮选择，对靶细胞(对细胞进行或未进行预清理)的选择分支应用差异选择方法。在该轮中，文库分割到多个管中并平行地结合各个细胞类型和来自疾病不同阶段的患者细胞。该策略使得能够通过深度测序分析和鉴别识别疾病进展产生的不同表位的结合剂而直接比较靶细胞与其他细胞类型。
[0058]对于所有选择分支，在结合后，细胞用1mL结合缓冲液洗涤，并经历NotI限制性消化以回收所有的膜蛋白结合剂或经历PLC剪切以回收GPI锚定膜蛋白的结合剂，如上所述。
[0059]D.深度测序分析以预测靶细胞的选择性结合剂
[0060]在每轮选择后，结合池进行PCR扩增。通过使用引发VH片段的框架3的C端和框架4的N端的寡聚物进行PCR来增加每个结合池的HCDR3。然后使用用于通过PCR进行Illumina测序的特定DNA条形码标记从单独选择轮次和分支获得的这些HCDR3片段。标记的HCDR3合并，并发送用于使用Hi Seq技术的高通量测序。靶细胞的第4轮结合池也用DNA条形码标记并经受454测序以获得全长VH序列。
[0061 ] 序列在测序后基于DNA条形码去卷积(deconvolute)。通过比较存在于不同轮次和选择分支的特定CDR3序列的频率将从每个选择轮和选择分支获得的数百万序列制表。用于鉴别选择性结合剂的标准是:I)从较早的轮次到较后的轮次对靶细胞而非对照或紧密相关细胞类型上的CDR3序列特异性富集;2)在差异选择轮次靶特异性细胞类型上的较高频率和对照或紧密相关细胞类型上的较低频率(参见图7);和3)不存在于来自数据库中其他程序的其他靶或细胞选择中的序列。然后基于454全长序列信息合成通过Illumina测序鉴别的选择性克隆。
[0062]E.产生、纯化和FACS结合分析
[0063]然后将结合池和合成的VH亚克隆到pET22b表达载体中。VH在BL-21 E.col i细胞中产生，并使用标准方案通过C端His标签纯化。进行FACS分析以评估VH对不同细胞类型的结合和选择性，以及结合剂的EC50。通过活细胞选择方法鉴别高亲和性和选择性VH结合剂(参见图8、9和10)。
【主权项】
1.一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括: a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上展示的细胞表面抗原接触;和 b.从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型外表面上的所述细胞表面抗原的至少一个文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述结合多肽的多样化核酸展示文库与第二细胞类型接触，所述第二细胞类型不展示在所述外表面上展示的所述抗原。3.—种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括: a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与表达细胞表面抗原的第一细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型的至少一个文库成员； b.将所述结合多肽的多样化核酸展示文库与不表达所述细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第二细胞类型的至少一个文库成员；和 c.选择特异性结合所述第一细胞类型但不特异性结合所述第二细胞类型的文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述多样化核酸展示文库是DNA展示文库。5.权利要求4所述的方法，其中所述DNA展示文库的每个成员包含结合多肽，所述结合多肽通过插入式DNA接头连接到编码所述结合多肽的DNA编码序列，其中所述DNA接头包含限制性核酸内切酶位点。6.权利要求5所述的方法，其中所述限制性核酸内切酶位点不存在于所述DNA展示文库的成员的编码序列中。7.权利要求5或6所述的方法，其中所述方法还包括物理分离所述分离的文库成员的所述DNA编码序列和连接的结合多肽。8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将完整的所述分离的文库成员与所述第一或第二细胞类型分离。9.权利要求8所述的方法，其中所述分离的文库成员通过酶裂解所述细胞表面抗原与所述第一或第二细胞类型分离。10.权利要求9所述的方法，其中所述细胞表面抗原通过糖脂锚连接到所述细胞表面，并且所述分离的文库成员通过磷脂酶裂解所述糖脂锚与所述第一或第二细胞类型分离。11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测定所述分离的文库成员的至少一部分的所述DNA编码序列。12.权利要求11所述的方法，其中所述DNA编码序列通过焦磷酸测序测定。13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质、聚糖或脂质。14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白O15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是重组抗原。16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是嵌合抗原。17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是天然表达所述细胞表面抗原的细胞。18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是经工程化以异源性表达所述细胞表面抗原的重组细胞。19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是正常细胞的疾病相关变异体。20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是肿瘤细胞。21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体或其片段。22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体VH或VL域。
【专利摘要】本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明的方法一般地包括将结合多肽的多样化核酸展示文库与细胞外表面上展示的细胞表面抗原接触；和从文库分离特异性结合细胞外表面上的细胞表面抗原的至少一个文库成员。
【IPC分类】G01N33/563, G01N33/68, G01N33/53, C12N15/11
【公开号】CN105659090
【申请号】
【发明人】陈艳, S·沙玛
【申请人】X博迪公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年6月20日