文并入本文)、Fynomers(参见，例如，Grabulovski等(2007)J B1l Chem 282(5):3196-3204，其通过引用全文并入本文)和Kunitz结构域肽(参见，例如，Nixon等(2006)Curr Opin Drug DiscovDevel 9(2): 261_8，其通过引用全文并入本文)。在某些实施方式中，结合多肽是抗体VH或VL域。
[0031]IV.细胞表面展示方法
[0032]在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，该方法包括:(a)将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型外表面上展示的细胞表面抗原接触;和(b)从文库分离特异性结合第一细胞类型外表面上的细胞表面抗原的至少一个文库成员，由此识别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽。在某些实施方式中，在步骤
(a)之前，结合多肽的多样化核酸展示文库与不展示在外表面上展示的抗原的第二细胞类型接触，以预清理不特异性结合抗原的结合多肽的文库。
[0033]在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，该方法包括:(a)将结合多肽的多样化核酸展示文库与表达细胞表面抗原的第一细胞类型接触，并从文库分离特异性结合第一细胞类型的至少一个文库成员；(b)将结合多肽的多样化核酸展示文库与不表达该细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从文库分离特异性结合第二细胞类型的至少一个文库成员；和(C)选择特异性结合第一细胞类型但不特异性结合第二细胞类型的文库成员，由此鉴别特异性结合该细胞表面抗原的结合多肽。
[0034]适用于本发明的方法的核酸展示文库在例如美国专利第7，195，880;6，951，725;7,078,197；7,022,479；6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,I16；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623，926;6，416，950;6，660，473;6，312，927;5，922，545;和6，348，315号中，以及在肌2010/011944中陈述，其均通过引用全文并入本文。在某些实施方式中，多样化核酸展示文库是DNA展示文库。在一种实施方式中，核酸展示文库是本文所述的或W02010/011944中的DNA展示文库，其通过引用全文并入本文。
[0035]在某些实施方式中，DNA展示文库的每个成员包含结合多肽，该结合多肽通过插入式DNA接头(intervening DNA linker)连接到编码该结合多肽的DNA编码序列，其中DNA接头包含限制性核酸内切酶位点(参见，例如，图1)。可以采用任意限制性核酸内切酶位点。在一种特定实施方式中，限制性核酸内切酶位点不存在于DNA展示文库的成员的DNA编码序列中，由此避免在限制性核酸内切酶消化文库成员时裂解DNA编码序列。在一种特定实施方式中，限制性核酸内切酶位点是Notl位点。
[0036]在某些实施方式中，期望物理分离所分离的文库成员的DNA编码序列和连接的结合多肽。可以采用任何物理分离方法。在分离的文库成员包含含有限制性核酸内切酶位点的DNA接头的情况下(参见，例如，图1)，可以通过限制性核酸内切酶消化分离的文库成员来实现物理分离。所得的释放出的DNA编码序列可以通过任何本领域认可的方法(例如离心)与细胞/结合多肽复合体进一步分离。
[0037]在某些实施方式中，期望的是物理分离完整的分离的文库成员与第一和/或第二细胞类型。可以采用任何物理分离方法。在某些实施方式中，分离的文库成员通过酶裂解细胞表面抗原与第一或第二细胞类型分离。可以采用任何酶裂解抗原的方法，例如蛋白酶、月旨质和/或糖苷酶酶促裂解。在某些实施方式中，在细胞表面抗原通过糖脂锚连接到细胞表面的情况下，分离的文库成员通过磷脂酶裂解糖脂锚而与第一或第二细胞类型分离。所得的释放出的分离的文库成员可以通过任何本领域认可的方法(例如离心)与第一或第二细胞类型进一步分离。
[0038]一旦分离出特异性结合第一和/或第二细胞类型的文库成员，可以测定这些分子的DNA编码序列。因此，在某些实施方式中，本发明的方法还包括测定分离的文库成员的至少一部分的DNA编码序列的步骤。可以采用任何本领域认可的DNA序列测定方法。在一种特定实施方式中，通过单分子深度测序技术(例如，焦磷酸测序)测定DNA编码序列。单分子深度测序技术在本领域中广为人知(参见，例如，US6，210，891中所述的那些，其通过引用全文并入本文)。在某些实施方式中，在结合多肽是抗体或其抗原结合片段的情况下，测定CDR3区的DNA编码序列。在某些实施方式中，测定结合第一和第二细胞类型的文库成员的DNA编码序列。特异性结合第一细胞类型但不特异性结合第二细胞类型的文库成员被认为包含特异性结合对第一细胞类型特异性的抗原的结合多肽。
[0039]—旦鉴别出特异性结合细胞表面抗原的结合多肽，其可以在体外(例如，在细胞中或在无细胞表达系统中)或体内(例如，在转基因动物中)异源表达。因此，在某些实施方式中，本发明的方法还包括体外(例如，在细胞中或在无细胞表达系统中)或体内(例如，在转基因动物中)异源表达所鉴别的结合多肽的步骤。
[0040]在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前已知抗原的身份。然而，并非必须知晓抗原的身份。实际上，在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前未知抗原的身份。因此，在后一情形中，本发明的方法允许鉴别存在于感兴趣的细胞类型(例如，肿瘤细胞)表面上的新抗原和表位。
[0041]在某些实施方式中，本文公开的方法包括选择能够在结合到细胞表面抗原时功能性内化的结合多肽。这种结合多肽在药物偶联物的生产中特别有用，因为它们使得能够将细胞毒性药物递送到靶细胞内部。可以采用任何筛选功能内化的方法。例如，结合多肽的多样化核酸展示文库可以在允许结合多肽内化的条件(例如，37°C下约1-2小时)下与靶细胞接触。然后洗涤细胞并在蛋白酶抑制剂的存在下用细胞裂解缓冲液裂解。然后乙醇沉淀内化的文库成员，并通过PCR扩增富集DNA编码序列。
[0042]本文公开的方法可以应用于任何靶表位发现方法。例如，靶表位可包括:炎症的归巢(homing)域;来自对治疗具有或不具有耐受性的原发肿瘤、肿瘤细胞系和携带可以导致新表位的任何突变的肿瘤的肿瘤特异性靶表位;和介导疾病特异性功能障碍并作为生物疗法的靶标的其他疾病特异性表位。
[0043]本文公开的方法也可应用于生物标志物的发现，以监测特定细胞表面表位在患者药物治疗的过程中的存在或不存在。从生物标志物发现获得的抗体也可用作生物标志物检测的工具。
[0044]另外地或替代性地，本文公开的方法可以应用于其他物种中的靶或表位发现，例如转基因动物和动物疾病模型中。
[0045]V.示例
[0046]A.概要
[0047]构建从人供体的骨髓、外周血和脾细胞获得的完全人抗体VH文库，并使用dsDNA展示技术鉴别对于多种靶的高亲和性和特异性的众多VH结合剂。使用人VH文库和dsDNA展示技术，通过活细胞选择和深度测序分析鉴别靶细胞特异性表位。在这些方法中应用平行的差异选择和靶细胞选择性选择的策略(参见图4、5、6)。来自所有轮次的所有池的深度测序的CDR频率的制表预测VH克隆的选择性。鉴别选择性结合靶细胞和相关细胞类型的高亲和性VH。
[0048]B.活细胞表位发现的文库工程化和选择方法
[0049]开发了两种方法来有效回收结合活细胞的文库成员。
[0050]第一种方法涉及通过限制性消化与结合的抗体融合的DNA来从活细胞剥离结合剂。该方法使得能够完全回收结合到细胞上的所有表位的VHοVH DNA文库的C端经工程化以携带No11限制性位点(参见图1)。天然VH框架中没有No11位点，且因此只有全长VH结合剂从细胞洗脱以进行后续扩增。在活细