用于鉴别靶细胞特异性靶表位的靶抗原发现、表型筛选及其用图
【专利说明】用于鉴别靶细胞特异性靶表位的靶抗原发现、表型筛选及其用途
[0001 ] 相关申请
[0002]本申请要求涉及2013年6月28日提交的名称为“勒抗原发现和表型筛选”的美国临时申请第61/840，583号的优先权，其内容全文并入本文。
[0003]发明背景
[0004]结合多肽，例如抗体及其片段，作为治疗和诊断剂在商业上十分重要。筛选结合多肽的传统方法一般采用可溶性抗原。然而，对于某些细胞表面抗原，这些抗原上的构象表位在抗原从质膜溶出(solubilized)时改变，导致不能产生可以识别天然抗原的结合多肽。因此，本领域需要筛选可以特异性结合处于其天然构象的细胞表面抗原的结合多肽的新方法。
【发明内容】
[0005]本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明的方法一般地包括将结合多肽的多样化核酸展示文库与细胞外表面上展示的细胞表面抗原接触;和从文库分离特异性结合细胞外表面上的细胞表面抗原的至少一个文库成员。本发明的方法和组合物特别有利的地方在于它们允许快速鉴别结合靶细胞表面抗原的天然形式的结合多肽。这些方法和组合物也允许鉴别新型的、有治疗作用的细胞类型特异性抗原或表位。
【附图说明】
[0006]图1是本发明的示例性DNA展示组合物和筛选方法的示意图。
[0007]图2是本发明的示例性DNA展示组合物和筛选方法的示意图。
[0008]图3是本发明的方法中采用的示例性靶细胞筛选策略的示意图。
[0009]图4是本发明的方法中采用的示例性平行筛选和深度测序策略的示意图。
[0010]图5是本发明的方法中采用的示例性平行筛选和深度测序策略的示意图。
[0011]图6是本发明的方法中采用的示例性平行筛选和深度测序策略的示意图。
[0012]图7是本发明的方法中采用的示例性平行筛选策略结果的示意图。
[0013]图8描绘了示出使用本发明的方法选择的高亲和性VH分子的基于FACS结合分析的结果的图。
[0014]图9描绘了示出使用本发明的方法选择的VH分子的差异结合的图。
[0015]图10描绘了示出使用本发明的方法选择的VH分子的差异结合的图。
[0016]详细描述
[0017]1.定义
[0018]本文所用术语“核酸展示文库”是指任何本领域认可的体外无细胞表型-基因型相联展示，包括，但不限于如例如美国专利第7，195，880;6，951，725;7，078，197;7，022，479;6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6,416,950；6,660，473;6，312，927;5，922，545;和6，348，315号中，以及在肌2010/011944中陈述的那些，其均通过引用全文并入本文。
[0019]本文所用术语“抗原”是指被结合多肽识别的分子。
[0020]本文所用术语“特异性结合”是指结合分子(例如VH或VL域)以至少约1x10—6M、1x10—7M、1x10—8M、1x10—9M、1x10—1qM、1x10—nM、1x10—12M 或更高的亲和性结合抗原，和/或以比其对非特异性抗原的亲和性高至少2倍的亲和性结合靶的能力。
[0021]本文所用术语“抗体”是指包含四条多肽链的免疫球蛋白分子一一通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链——及其多聚体(multimer)(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个域，CHl、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含I个域(CLl) 和VL区可进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守的称为框架区(FR)的区域。
[0022]本文所用术语抗体的“抗原结合部分”包括特异性结合抗原以形成复合体的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。使用任何适合的标准技术，例如蛋白水解消化或重组基因工程技术(包括操纵和表达编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA)，可以从例如完全抗体分子获得抗体的抗原结合片段。抗原结合部分的非限制性实例包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段;和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基构成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR))。其他工程化分子，例如双体、三体、四体和微型抗体(minibodies)也包含在表述“抗原结合部分”中。
[0023]本文所用术语“VH±或”和“VL±或”分别指单个抗体重链和轻链可变域，包含FR(框架区)1、2、3和4以及CDR(互补决定区)1、2和3(参见Kabat等，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest.(NIH Publicat1n N0.91-3242,Bethesda))。
[0024]I1.细胞表面抗原
[0025]在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法。
[0026]任何能够在细胞表面上展示的抗原都可用于本发明的方法中，包括但不限于，蛋白质、聚糖和/或脂质抗原。在某些实施方式中，抗原是天然存在的分子。天然存在的抗原的适合的非限制性实例包括跨膜蛋白(例如，G蛋白偶联受体)和GPI锚定蛋白。在某些实施方式中，抗原是非天然存在的重组或合成抗原。天然存在的抗原的适合的非限制性实例包括包含来自不同抗原分子的部分的嵌合抗原。在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前已知抗原的身份。在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前未知抗原的身份。
[0027]本发明的方法中采用的细胞表面抗原可以在任何细胞或细胞样颗粒(例如，脂质囊泡)上展示。在某些实施方式中，细胞是天然表达细胞表面抗原的细胞类型。在某些实施方式中，细胞是工程化以异源性表达细胞表面抗原的重组细胞。在某些实施方式中，细胞是正常细胞的疾病相关变异体(例如，肿瘤细胞)。
[0028]II 1.结合多肽
[0029]在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法。
[0030]任何类型的结合多肽都可用于本发明的方法中，包括但不限于，抗体或其片段及免疫球蛋白样结构域。适合的免疫球蛋白样结构域包括但不限于纤连蛋白结构域(参见，例如，Koide等，(2007) ,Methods Mol.B1l.352:95-109，其通过引用全文并入本文)、DARPin(参见，例如，Stumpp等(2008)Drug Discov.Today 13(15-16):695-701，其通过引用全文并入本文)、蛋白质A的Z结构域(参见，Nygren等(2008)FEBS J.275( 11):2668-76，其通过引用全文并入本文)、脂质运载蛋白(参见，例如，Skerra等(2008)FEBS J.275(11): 2677-83，其通过引用全文并入本文)、Affilins(参见，例如，Ebersbach等(2007)J.Mol.B1l.372(1):172-85，其通过引用全文并入本文)、Af fitins(参见，例如，Krehenbr ink等(2008).J.Mol.B1l.383(5): 1058-68，其通过引用全文并入本文)、Avimers (参见，例如，Si Iverman等(2005 )Nat.B1technol.23(12): 1556-61，其通过引用全