数值 称为成斑率。通常是选取噬菌斑最多的指示菌和条件作为标准。
[0033]图3中，白色箭头所指的是4号抗菌剂(石炭酸），其周围噬菌斑的密度均明显低于 其他区域，即成斑率降低，说明4号抗菌剂对两种噬菌体的杀菌均起明显抑制作用，因此，这 种噬菌体不能与4号抗菌剂合用。
[0034]图4中，白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低，即2号(双氧水)和4号 (石碳酸)抗菌剂对噬菌体的杀菌起明显抑制作用，因此，这种噬菌体不能与2号和4号抗菌 剂合用。
[0035]图5中，白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低，即1号（84消毒液）、2 号(双氧水)和4号(石碳酸)抗菌剂对噬菌体杀菌均起明显抑制作用，因此，这种噬菌体不能 与1号、2号和4号抗菌剂合用。
[0036]图6中，两个黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显增高，即4号抗菌剂对 图中两种噬菌体的杀菌均起明显促进作用，因此，这两种噬菌体都可以与4号抗菌剂合用。 [0037]图7中，黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率明显增高，即4号抗菌剂对图中噬 菌体的杀菌起明显促进作用;两个白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低，即3 号(苯扎溴铵)和5号(碘伏)抗菌剂对图中噬菌体的杀菌起明显抑制作用，抑制的不能合用， 促进的可以合用。
[0038]抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌斑的大小和形态变化的部分实 验结果如图8~9所示。
[0039]图8中，灰色箭头所指抗菌剂透明圆的周围区域噬菌斑均明显增大，即4号抗菌剂 对图中两种噬菌体的杀菌均起明显促进作用，因此，这种噬菌体能与4号抗菌剂合用。
[0040]图9中，图中所有箭头指的都是形态发生较大改变的噬菌斑，有的被抗菌剂所形成 的透明圆"拉长"（如图中白色箭头所指），有的被透明圆"挤压"（黑色箭头所指），"拉长"者 为抗菌剂对噬菌体成斑的促进作用，"挤压"者为抗菌剂对噬菌体成斑的抑制作用。
[0041 ]抗菌剂与噬菌体联合使用时，与噬菌斑相邻抑菌圆的形态变化的部分实验结果如 图10所示。
[0042] 图10中，图中白色环所在区域的抑菌圆为双层，外层为半透明环，是对低浓度抗菌 剂抵抗的抗性菌生长的区域;半透明环内部则完全透明，是高浓度抗菌剂作用于细菌后留 下的无细菌生长的区域。白色环圈住的与抑菌圆毗邻的噬菌斑均改变了抑菌圆外层的形 态，使其由半透明变为透明，说明在一定浓度抗菌剂存在条件下，噬菌体可更高效的裂解对 此抗菌剂抵抗的细菌，二者合用会降低抗性菌出现的几率。
[0043] 抗菌剂与噬菌体联合使用时，对于不同菌株的相互影响结果进行汇总，结果如下 表所示：
[0044] 上表中，"丨数"表示该行中降低数，"Sr :代表抗菌剂的存在可使噬菌斑增大；"S Γ :代表抗菌剂的存在可使噬菌斑缩小；"ΝΓ :代表抗菌剂的存在可增高成斑率；"ΝΓ :代表 抗菌剂的存在可降低成斑率；"一"：代表抗菌剂对噬菌体的成斑影响不明显。
[0045] 从上表中可以看出，28株噬菌体对其最敏感宿主菌的杀菌受6种常用消毒剂的影 响情况各不相同。其中，除?41、？?5、？?9、？？14、？？16、？1^1和?1^这7株噬菌体的杀菌不受6种 消毒剂的抑制外，其他噬菌体的杀菌均受1到3种消毒剂的抑制。其中，仅受1种消毒剂抑制 的噬菌体最多，为10株，受2种消毒剂抑制的噬菌体为8株，受3种消毒剂抑制的噬菌体仅为3 株。抑制这些噬菌体杀菌的消毒剂种类主要集中在苯扎溴铵。
[0046] 6种消毒剂对噬菌体杀菌影响（仅依据上表数据进行统计)进一步进行统计，结果 如下表：
[0047] 上表中，τ' ：代表促进噬菌体杀菌；T :代表抑制噬菌体杀菌；"一"：代表对噬菌 体杀囷影响不明显。
[0048] 从上表可以看出，6种消毒剂中，低浓度苯扎溴铵的存在对噬菌体杀菌的抑制几率 最大，约57%的噬菌体杀菌均受其抑制。低浓度戊二醛的存在对噬菌体杀菌的抑制作用最 小，所有噬菌体杀菌均未出现明显的抑制作用。另外，6种消毒剂影响28株噬菌体杀菌的所 有反应中，仅有21%的噬菌体杀菌受到明显抑制，明显增强的反应达50%，其余29%的反应受 消毒剂的影响不明显。
[0049] 上述结果表明：环境中有低浓度消毒剂残留的情况下，噬菌体杀菌受明显抑制作 用的仅占少数。
[0050] 总体而言，通过采用本发明中所提供的化学抗菌剂筛选方法，可获得噬菌体与抗 菌剂的联合应用的最佳组合，为改善抗菌效果、降低化学抗菌剂用量提供了较好的指导。
【主权项】
1. 一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤： (1) 制备双层固体培养基，其中底层为固体培养基，顶层为半固体培养基； (2) 接种病菌和噬菌体，在步骤（1)中的顶层的半固体培养基中接种菌液和对应的噬菌 体，混合均匀后，将半固体培养基倾倒于步骤(1)中的固体培养基中，并铺匀，室温凝固； (3) 加入化学抗菌剂，在步骤(2)中凝固后的双层培养基中滴加化学抗菌剂或采用粘贴 具有一定浓度化学抗菌剂的纸片，培养并观察噬菌斑以进行判断； 判断时，依据噬菌体成斑率、噬菌斑大小和形态变化、化学抗菌剂抑菌区透明度变化三 个方面单独或者联合对化学抗菌剂与噬菌斑合用的灭菌效果进行判定； 依据噬菌体成斑率进行判断时，观察化学抗菌剂作用区域噬菌体成斑率的变化，成斑 率增高即表明化学抗菌剂对噬菌体杀菌起促进作用，成斑率降低即表明化学抗菌剂对噬菌 体杀菌起抑制作用； 依据噬菌斑大小或形态变化进行判断时，观察化学抗菌剂作用区域噬菌斑，如果噬菌 斑增大，或向消毒剂抑菌圈方向局部增大而被"拉长"，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起促 进作用；反之，观察化学抗菌剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑减小，或向消毒剂抑菌圈方向 局部缩小而被"挤压"，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用； 依据化学抗菌剂抑菌区透明度变化进行判断时，观察与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌 区透明度的变化，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度增加，表明化学抗菌剂对 噬菌体灭菌起促进作用;反之，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度降低，表明化 学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用。2. 如权利要求1所述噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，步骤（1)中所述 固体培养基和半固体培养基均为LB培养基，固体培养基中琼脂粉用量为1.5%的质量比例， 半固体培养基中琼脂粉用量为0.5%的质量比例。3. 如权利要求1所述噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，步骤（1)中培养 基用10mL/平皿盛放，步骤(2)中菌液浓度为10 9 CFU/mL，接种量为lOOyL，步骤(3)中化学抗 菌剂滴加量为5yL。4. 如权利要求1所述噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其特征在于，所述菌液中菌体 为肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌或大肠埃希菌，所述化学抗菌 剂为84消毒液、双氧水、苯扎溴铵、石碳酸、碘伏或戊二醛。
【专利摘要】本发明属于医疗卫生保健技术领域，具体涉及一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法。该方法具体包括制备双层固体培养基、接种病菌和噬菌体、加入抗菌剂、观察判定等步骤。本申请以部分特定菌株和噬菌体及部分广谱性的抗菌剂为代表，对于噬菌体与化学抗菌剂联用时的相互作用、相互影响进行了初步探讨，所提供的噬菌体灭菌时的化学抗菌剂的筛选方法，为筛选获得噬菌体与抗菌剂的最佳组合，以期获得最佳抗菌效果提供了较好的技术保障。总体而言，本发明所提供的化学抗菌剂的筛选方法，操作简单、结果稳定、可信度高，且容易观察和判断，因而在卫生保健领域具有较好地应用前景。
【IPC分类】C12Q1/70, C12R1/92, C12Q1/18
【公开号】CN105648109
【申请号】
【发明人】靳静, 李振江, 黄德海, 张改, 陈松健, 王书伟, 李亚辉, 王小亭, 王山梅, 杨朝宽
【申请人】河南医学高等专科学校
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月8日