，菌株为肺炎克雷伯菌A5;右上图的噬菌体为PF1，菌 株为肺炎克雷伯菌F1;左下图的噬菌体为PF4，菌株为肺炎克雷伯菌F1;右下图的噬菌体为 PF7，菌株为肺炎克雷伯菌F7;图中所有箭头指的都是形态发生较大改变的噬菌斑； 图10为抗菌剂与噬菌体联合使用时，与噬菌斑相邻抑菌圆的形态变化的部分实验结 果，其中左图的噬菌体为PF14，菌株为肺炎克雷伯菌F9;中图的噬菌体为TO62，菌株为大肠 埃希菌D62;右图的噬菌体为PF13,菌株为肺炎克雷伯菌F99,图中白色环所在区域的抑菌圆 为双层。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中 所涉及的噬菌体、抗菌剂等信息简要介绍如下。
[0016] 下述实施例中所采用的化学抗菌剂有6种，分别为:84消毒液（1号消毒剂）、双氧水 (2号消毒剂）、苯扎溴铵(3号消毒剂）、石碳酸(4号消毒剂）、碘伏(5号消毒剂）、戊二醛(6号 消毒剂）。这6种抗菌剂属于常用的化学消毒剂，因而均可从医药商店或者医院常规购买获 得。
[0017]需要解释的是，因语言习惯问题，本发明中化学抗菌剂、消毒剂、抗菌剂、抑菌剂等 名词虽然描述方式不同，但含义相同，均是指常用的人工合成的或天热存在的、物质较为单 一的化学类抑菌类物质。
[0018] 下述实施例中所采用的菌株均来源于临床标本中常见的多重耐药菌或致病菌，包 括多株肺炎克雷伯菌(可杀灭这些菌株的噬菌体分别命名为PF1、PF2等）、多株铜绿假单胞 菌(可杀灭这些菌株的噬菌体分别命名为PL1、PL2等)和多株鲍曼不动杆菌(可杀灭这些菌 株的噬菌体分别命名为PA1、PA2等）等。对于这些细菌的鉴定采用法国生物梅里埃公司生 产的细菌生化鉴定板条进行鉴定。所用噬菌体均为以上述致病菌为宿主菌从环境中分离、 鉴定并保存的噬菌体，实验培养表明，上述菌株噬菌体的噬菌谱均存在明显差异，表明噬菌 体各自的特异性。同时，每株噬菌体最为敏感的宿主菌均通过噬菌斑大小和成斑率高低的 比较来决定，实验过程中，噬菌体的命名序号均与其最为敏感的宿主菌的序号一致。
[0019] 需要说明的是，上述内容中所述菌株、噬菌体在各医疗场所普遍存在，经常规筛选 即可获得，且由于相应菌株、噬菌体并非本发明核心，因而不需进行微生物保藏。 实施例
[0020] 本发明所提供的噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，其技术原理是：利用化学抗 菌剂在含有密度均匀的致病菌的半固体培养基中扩散可形成不同浓度梯度为背景，观察不 同浓度抗菌剂的区域内噬菌体的噬菌斑形态以及成斑率变化情况，从而对抗菌剂与噬菌体 之间的相互影响做出定性判断，以获得最适噬菌体和化学抗菌剂的浓度组合。详细过程介 绍如下。
[0021 ] -种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，具体包括如下步骤： (1)制备培养基，本发明中采用双层固体培养基，具体为： 其中底层为固体培养基，即加入1.5%的琼脂粉到LB培养基中加热完全融化后按常规方 法高压灭菌，无菌环境倾倒于无菌的9cm平皿中（10mL/平皿），制成固体培养基，凝固后置4 °(：保存待用，使用前置37°C下预热； 顶层为半固体培养基，即加入0.5%的琼脂粉到LB培养基中加热完全融化后分装于玻璃 试管中（3mL/管），加盖后按常规方法高压灭菌，趁热置于45°C水浴中保温以避免凝固。 [0022] (2)接种病菌和噬菌体，具体为，将lOOyL菌液（10 9 CFU/ml)和lOOyL噬菌体悬液分 别加入到步骤(1)中的半固体培养基中，混合均匀后，倾倒于步骤(1)中的固体培养基中，并 铺匀，室温(20~25°C)凝固； 需要解释的是，待测的各种噬菌体悬液浓度应以平皿培养基表面菌苔上噬菌斑不构成 相互融合的最大噬菌体浓度为最佳。由于噬菌斑的大小可因噬菌体和菌株种类的不同可呈 现较大差异，因此不同噬菌体所需的悬液浓度并不是固定的。
[0023] (3)加入抗菌剂，在步骤(2)中凝固后的双层培养基中滴加5tiL化学抗菌剂，培养后 (培养时以所接种病菌的最适生长温度为宜，培养时间约为8~48h，针对生长缓慢的病菌菌 株可延长培养时间），观察噬菌斑并进行判断。需要说明的是，培养时间可根据不同细菌生 长速度适当做调整，即培养时间等于菌苔的透明度达到稳定所需的时间。
[0024]在本实施例中，接种的病菌有肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟 肠杆菌、大肠埃希菌;采用的噬菌体为用这些多重耐药菌株作为指示菌从环境中分离获得； 具体如后文附表所列。
[0025]所加入抗菌剂有:有效氯含量4.0%~5.5%(w/v)的84消毒液（1号消毒剂）、30%的双 氧水(2号消毒剂）、0.05g/L的苯扎溴铵(3号消毒剂）、20%的石碳酸(4号消毒剂）、有效碘含 量4.5g/L~5.5g/L的碘伏(5号消毒剂）、25%的戊二醛(6号消毒剂）。需要说明的是，下述实施 例中抗菌剂的滴加顺序与图2保持一致。
[0026] 在本实施例中，所用噬菌体悬液浓度范围为500~2000PFU/ml，实际实验中噬菌体 悬液浓度可根据不同噬菌体在平皿培养基表面菌苔上形成的噬菌斑大小做适当调整，噬菌 斑较大时，应将悬液中噬菌体数应调整的相对少些，噬菌斑较小时，悬液中噬菌体数应调整 的相对多些。总之，实际实验中噬菌体悬液浓度应以平皿培养基表面菌苔上噬菌斑不构成 相互融合的最大噬菌体浓度为最佳噬菌体悬液浓度。
[0027] 实际实验中所用各种消毒剂的浓度只要高于有效杀菌浓度即可，一般可采用未经 稀释的标准商品出售包装内的消毒剂原液浓度为实验浓度，如果某种抗菌剂商品的原液所 形成的抑菌区过大，可根据具体情况先做适当稀释后再使用。
[0028] 在本发明中，由于采用的为双层固体平皿培养基，在顶层培养基中，含有待抑制的 细菌和能够裂解这种细菌并能形成噬菌斑的噬菌体。此时在培养基表面滴加化学抗菌剂 后，抗菌剂会以滴加区域为圆心向周围琼脂中扩散，离圆心越近浓度越高，越远便越低，同 一个同心圆上的浓度是相似或相同的。在有效杀菌或抑菌浓度下细菌的生长会受到抑制， 因此会留下没有细菌生长的圆形透明区（透明圆）。由于顶层培养基中还含有一定数量的噬 菌体，在抗菌剂形成透明区的过程中，这些噬菌体也会在菌苔上形成噬菌斑，由于噬菌斑数 量多（不会构成噬菌斑融合的最大数量），且在菌苔表面均匀分布，因此，不同浓度抗菌剂的 分布区都会有菌斑的形成。
[0029] 如果化学抗菌剂对噬菌体的杀菌有影响，即会影响到噬菌斑的形成过程，使其形 态发生改变。因此，通过观察不同区域噬菌斑的形态和成斑率的变化，即可对噬菌体与化学 抗菌剂的相互影响作出直观的定性判断。
[0030] 噬菌斑是噬菌体感染菌苔中的一个细菌后，在细菌体内快速的复制增殖，大量子 代噬菌体随细菌破裂后被释放于周围培养基中，再经过扩散感染临近的细菌，这样周而复 始，便形成一个无细菌生长的透明区域，即噬菌斑。不同的噬菌体所形成的噬菌斑形态存在 差异。图1为未滴加抗菌剂情况下，噬菌体所形成噬菌斑形态。从图1中可以看出，噬菌斑有 的大(如B和C)、有的小(如D)，有的还带有晕环(如B和C)。
[0031] 图2为6种抗菌剂在顶层半固体培养基菌苔上形成抑菌区的形态(不含有噬菌体）， 其中图中A、B、C、D展示的是4种不同的临床菌株对6种抗菌剂的敏感性。在图2中，透明圆形 区即是因不同抗菌剂对细菌生长的抑制作用所形成的，其直径与抗菌剂的强弱成正比。比 较图中同一编号抗菌剂在不同菌苔上形成的透明圆的直径和透明度即可作为敏感性的评 判指标。因为，透明区的直径大小可有效反应抗菌剂的抗菌能力，二者呈正比。即抗菌能力 越强，透明区直径越大，反之亦然。
[0032] 抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌体成斑率变化情况的部分实验 结果如图3~7所示。对于成斑率(efficiency of plating)，常简称为EOP，其含义为菌体 和指示菌一起涂布在琼脂培养基上所生成的噬菌斑数。噬菌斑数可因指示菌的种类或条件 不同而异。如在标准条件下，用某种标准指示菌所得噬菌斑数为1，则将某株菌所得的