一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗卫生保健技术领域，具体涉及一种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选 方法。
【背景技术】
[0002] 化学抗菌剂通常包括用于体外的消毒剂(如环境消毒和生物体表皮肤黏膜消毒） 和用于生物体内治疗感染的天然抗生素或人工合成的抗菌药物。在医疗卫生保健技术领 域，为快速、有效控病菌感染，常需大量使用各种类型的化学抗菌剂进行灭菌处理。然而，随 着大量广谱类抗菌剂的长期使用，细菌耐药问题逐年加剧，一系列耐药病原菌，如结核杆 菌、金萄菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌和铜绿假单胞菌等病原菌耐 药菌株的出现，引起公众的广泛关注，这也是人们意识到，寻找新的、更为环保和生态的抑 制病原菌的用药方式是解决细菌耐药问题根本出路。
[0003] 噬菌体是一种可以感染并裂解杀灭细菌的天然存在的病毒，最早由Twort和 Herelle D两人分别于1915年和1917年发现。由于其对人和动物无害，因此可将杀菌能力强 的噬菌体用于自然环境和生物体内环境中的杀菌，以达到防治细菌感染体目的。由于噬菌 体灭菌方式的环保性、高效性、特异性，因而使得人们近年对于噬菌体灭菌技术重新产生了 浓厚的兴趣。
[0004]在化学抗菌剂仍是控制细菌感染主流方法的背景下，采用噬菌体灭菌作为化学抗 菌剂的补充具有十分重要的意义。但实际应用过程中，由于噬菌体种类繁多（自然界中超过 1〇8种），化学抗菌剂的种类也很多，加之在应用噬菌体杀菌的环境中常常会有化学抗菌剂 的残留，而噬菌体与化学抗菌剂杀菌机制又完全不同，因而在噬菌体与化学抗菌剂联合使 用时，如何在种类繁多的噬菌体和化学抗菌剂中选择出最佳的组合，是首先需要解决的关 键问题。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种噬菌体灭菌时，筛选可以联合使用的化学抗菌剂的方法， 从而为噬菌体与化学抗菌剂的联合应用提供可靠保障。
[0006] 本发明所采取的详细技术方案如下所述。
[0007] -种噬菌体灭菌时化学抗菌剂筛选方法，具体包括如下步骤： (1) 制备培养基，本发明中采用双层固体培养基，具体为： 首先制备底层固体培养基，即加入1.5%的琼脂粉的LB培养基，灭菌后，无菌环境下倾倒 于无菌的9cm平皿中（1 OmL/平皿），制成固体培养基，凝固后置4°C保存待用，使用前置37 °C 下预热； 其次制备顶层用半固体培养基，即加入0.5%的琼脂粉的LB培养基，将培养基融化后分 装于玻璃试管中（3mL/管），加盖灭菌后，趁热置于45°C水浴中保温以避免凝固； (2) 接种病菌和噬菌体，具体为，将lOOyL菌液(109 CFU/ml)和lOOyL噬菌体悬液分别加 入到步骤（1)中的半固体培养基中，混合均匀后，倾倒于步骤（1)中的固体培养基中，并铺 匀，室温(20~25°C)凝固； 需要解释的是，噬菌体悬液浓度以前期的预实验结果为准，对于噬菌体悬液浓度进行 控制主要是控制噬菌体在每个平皿中形成噬菌斑的数量，由于不同噬菌体所形成的噬菌斑 的大小不同，因此噬菌体数量(噬菌体悬液浓度)并不是固定的，但以不会构成融合的最大 噬菌斑数为最佳； (3)加入抗菌剂，在步骤(2)中凝固后的双层培养基中滴加5tiL化学抗菌剂，培养约8~ 48h(培养时以所接种病菌的最适生长温度为宜），观察噬菌斑并进行判断； 需要解释的是，滴加化学抗菌剂后培养时间可根据不同细菌生长速度适当做调整，即 培养时间等于菌苔的透明度达到稳定所需的时间； 判断时，可依据噬菌体成斑率、噬菌斑大小和形态变化、化学抗菌剂抑菌区透明度变化 等单独或者联合对化学抗菌剂与噬菌斑合用的灭菌效果进行判定； 依据噬菌体成斑率进行判断时，观察消毒剂作用区域噬菌体成斑率的变化，成斑率增 高即表明化学抗菌剂对噬菌体杀菌起促进作用，成斑率降低即表明化学抗菌剂对噬菌体杀 菌起抑制作用； 依据噬菌斑大小或形态变化进行判断时，观察消毒剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑明 显增大，或向消毒剂抑菌圈方向局部增大而被"拉长"，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起促 进作用；反之，观察消毒剂作用区域噬菌斑，如果噬菌斑明显减小，或向消毒剂抑菌圈方向 局部缩小而被"挤压"，表明化学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用； 依据化学抗菌剂抑菌区透明度变化进行判断时，观察与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌 区透明度的变化，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度增加，表明化学抗菌剂对 噬菌体灭菌起促进作用;反之，如果与噬菌斑相邻处化学抗菌剂抑菌区透明度降低，表明化 学抗菌剂对噬菌体灭菌起抑制作用。
[0008] 实际应用过程中，滴加抗菌剂方式也可更改为粘贴具有特定浓度抗菌剂的纸片方 式进行实验。
[0009] 在本发明中，接种的病菌具体例如:肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、 阴沟肠杆菌、大肠埃希菌等;采用的噬菌体为用这些病菌作为指示菌从环境中分离获得的 特异性噬菌体。
[0010] 所述抗菌剂例如:84消毒液、双氧水、苯扎溴铵、石碳酸、碘伏、戊二醛或临床中所 用抗生素类药剂等。
[0011] 现有技术中，针对特定病菌筛选针对性的噬菌体的技术已经较为成熟，而且由于 噬菌体灭菌的特异性和环保性，因而实际抗菌、治疗过程中也有一定的应用试验。但由于现 有技术中针对病菌的灭菌、抗菌时仍以化学抗菌剂为主，因而在噬菌体与化学抗菌剂联用 时，其相互作用、相互影响如何尚缺乏较为系统的研究。
[0012] 本申请以部分特定菌株和噬菌体及部分广谱性的抗菌剂为代表，对于噬菌体与化 学抗菌剂联用时的相互作用、相互影响进行了初步探讨，所提供的噬菌体灭菌时的化学抗 菌剂的筛选方法，为筛选获得噬菌体与抗菌剂的最佳组合，以其获得最佳抗菌效果提供了 较好的技术保障。
[0013] 总体而言，本发明所提供的化学抗菌剂的筛选方法，操作简单、结果稳定、可信度 高，且容易观察和判断，因而在卫生保健领域具有较好地应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为未滴加抗菌剂时噬菌体所形成噬菌斑形态，其中A为噬菌体PL2在铜绿假单 胞菌L2菌苔上形成的噬菌斑，B为噬菌体PF8在肺炎克雷伯菌F8菌苔上形成的噬菌斑，C为噬 菌体PF2在肺炎克雷伯菌F2菌苔上形成的噬菌斑，D为噬菌体PA1在鲍曼不动杆菌A1菌苔上 形成的噬菌斑； 图2为6种抗菌剂在顶层半固体培养基中对不同菌株的菌苔上形成抑菌区的形态(不含 有噬菌体），其中A为肺炎克雷伯菌F7，B为肺炎克雷伯菌F4，C为铜绿假单胞菌L3，D为鲍曼不 动杆菌A4，1、2、3、4、5、6代表的是6种不同抗菌剂的编号； 图3为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中左 图的噬菌体为PF1，菌株为肺炎克雷伯菌F1;右图的噬菌体为PF12,菌株为肺炎克雷伯菌 F12,白色箭头所指的是4号抗菌剂(石炭酸）； 图4为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中菌 株为肺炎克雷伯菌F19,噬菌体为PF19,白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降 低； 图5为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中菌 株为肺炎克雷伯菌F6,噬菌体为PF18,白色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显降低； 图6为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中左 图噬菌体为PA3，菌株为鲍曼不动杆菌A3;右图噬菌体为PG7，菌株为阴沟肠杆菌G7;两个黑 色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率均明显增高； 图7为抗菌剂与噬菌体联合使用时部分菌株上的噬菌体成斑率变化情况结果，其中菌 株为肺炎克雷伯菌F13，噬菌体为PF13，黑色箭头所指抗菌剂的周围区域成斑率明显增高； 图8为抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌斑的大小和形态变化的部分 实验结果，其中左图的噬菌体为PL4，菌株为肺炎克雷伯菌L4;右图的噬菌体为PL1，菌株为 肺炎克雷伯菌L1，灰色箭头所指抗菌剂透明圆的周围区域噬菌斑均明显增大； 图9为抗菌剂与噬菌体联合使用时，抗菌剂作用区域噬菌斑的大小和形态变化的部分 实验结果，其中左上图的噬菌体为PA5