酵酶液或者固态发酵酶提取液离心除 渣，收集酶蛋白沉淀，将酶蛋白沉淀溶解于缓冲液中即可。
[0022] 具体可按如下方法:液态培养基的产酶诱导物加量为培养基质量的0.005~0.1%; 固态培养基的产酶诱导物加量为培养基质量的1~25%;发酵培养温度27~35°C，培养发酵 时间3~9天。对发酵酶液或者固态发酵酶提取液离心除渣，上清用硫酸铵、甲醇或者乙醇沉 淀酶蛋白，收集沉淀，其酶蛋白沉淀溶解于0.005~0.1摩尔、pH为4.5~6.5的醋酸、柠檬酸 或者磷酸缓冲液;溶解酶蛋白沉淀的缓冲液用量:液态发酵发酵液的1/5~1/20体积；固态 发酵发酵时，〇. 5~2倍固体原料的重量体积，即为可用的粗酶液。
[0023] 所述底物溶液与粗酶液反应是将底物溶液与粗酶液混合，在35~60°C反应16~48 小时;所述底物溶液与粗酶液的体积比为1: 〇. 1~1。
[0024]所述C步骤提取反应液中皂苷如下：加入反应液2~4倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋 白，得上清液，经脱色大孔树脂柱脱色、减压浓缩及回收有机溶剂得浓缩液，再将所得浓缩 液经大孔树脂柱反复吸附皂苷，用5~8倍柱体积的去离子水洗脱杂质，再用4~6倍柱体积 的质量浓度为80~96%的有机溶剂洗脱皂苷，浓缩、结晶及干燥洗脱液，得到人参稀有皂苷 C-K或人参稀有皂苷F1。所沉淀的酶蛋白，溶解于70~80%原酶液体积的缓冲液中，得到回收 酶液，可重复使用；即，酶不用固定化，重复使用。
[0025] 可以将所得到的人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1与从人参根中提取的人参自 身皂苷酶复合物反应，在60~85°C反应1.5~10小时，分别提取反应液中皂苷，得到由20 (S)-人参二醇皂苷元、20 (R)-人参二醇皂苷元、其20-羟基脱水的20 (21 )，24-二烯人参二醇 皂苷元和20 (22 )，24-二烯人参二醇皂苷元的四种异构体组成的人参二醇皂苷元;或者得到 20(S)_人参三醇皂苷元、20(R)_人参三醇皂苷元、其20-羟基脱水的20(21) ,24-二烯人参三 醇皂苷元和20(22) ,24-二烯人参三醇皂苷元的四种异构体组成的人参三醇皂苷元。
[0026]所述人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1与从人参根中提取的人参自身皂苷酶复 合物的质量比是1: 〇. 1~10，所述反应体系中加有反应体积〇. 1~50%的甲酸、乙酸或梓檬 酸，人身稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1反应质量浓度0.1~10%。
[0027]所述人参自身皂苷酶复合物按如下方法制备:在所述a步骤提取人参二醇类皂苷 混合物和人参三醇类皂苷混合物后的人参渣中，加入人参渣干重的5~6倍水，在55~75°C 搅拌2~3小时，离心收集上清，在65°C以下高真空浓缩至波美度20~25,即为人参自身皂苷 酶复合物。
[0028]本发明是以曲霉菌微生物发酵得到的粗酶与人参二醇类皂苷(Rbl、Rb2、Rb3、Rc、 Rd皂苷的混合物)或人参三醇类皂苷(Re、Rgl、Rl皂苷的混合物)反应，反应中加入有机溶剂 并控制反应温度，可高效制备人参稀有皂苷C-K和F1;所制备的人参稀有皂苷C-K或F1与人 参自身皂苷酶复合物反应，可分别制备四种异构体的人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元。 本发明产物得率及纯度高(均90%以上），几乎没有副产物皂苷，无需进一步分离，操作简单、 成本低，适合大批量生产;所得产品可用于药物开发、人参制品、保健品和化妆品。
【附图说明】
[0029]图1是本发明实施例3制备的人参二醇皂苷元异构体HPLC图。
[0030]图2是本发明实施例4制备的人参三醇皂苷元异构体HPLC图。
[0031]图3是本发明实施例5所分离得到的人参二醇皂苷元HPLC图。
[0032]图4是本发明实施例6所分离得到的人参三醇皂苷元HPLC图。
【具体实施方式】 [0033] 实施例1: a.以人参为原料，提取人参二醇类皂苷混合物和人参三醇类皂苷混合物： 人参(带须根）1公斤，切片(2~4毫米厚），加入8升甲醇浸泡，在35~40°C，搅拌提取6~ 12小时，分离提取液，重复三次;过滤、合并提取液，减压浓缩（回收甲醇）至比重波美度20， 加入500毫升石油醚、搅拌脱脂1小时，分离油脂层，重复2次。将脱脂后的人参提取液加3~5 倍体积的水稀释，经1.5升体积的大孔树脂(AB-8树脂或者HP-20树脂)柱中反复吸附皂苷， 用7.5~10升的去离子水洗脱柱，除糖等杂质;其吸附皂苷的大孔树脂柱，用乙醇-水梯度洗 脱：乙醇浓度梯度为30%~84%，洗脱剂总体积11升，每300毫升分部收集：用TLC方法检测皂 苷，其洗脱液前部分中含有原人参三醇类皂苷，洗脱液后部分中含有原人参二醇类皂苷;其 原人参三醇类皂苷部分、原人参二醇类皂苷部分，分别合并、分别减压浓缩（回收乙醇）、干 燥，得到20.3克人参三醇类(PPT)皂苷，31.7克人参二醇类(PH))皂苷。
[0034]同样的方法，甲醇或者70~80%的乙醇浸泡西洋参或者三七参，可分离提取原人参 二醇类皂苷和原人参三醇类皂苷。
[0035] 从人参或者西洋参根部中可提取4~8%的原人参二醇类皂苷和原人参三醇类皂 苷;从三七参根中可提取8~11%原人参二醇类皂苷和原人参三醇类皂苷。
[0036] b.以人参二醇类皂苷混合物为原料，与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，再将 底物溶液与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应： 所述粗酶液按照如下常规方法制备： 将黑曲霉菌Aspergillus niger g.848菌（从大曲中分离得到的；文献，刘春莹等J Ginseng Research 2015，39，221-229。大连工业大学菌种保藏所，保藏号:Aspergillus niger g.848菌)接种于含0.03%的人参总皂苷的5%麦芽汁培养基中，28~33°C培养、通风搅 拌发酵4~6天，离心除渣;在上清液中加入75%饱和度的硫酸铵粉，在4°C过夜，沉淀酶蛋白， 收集酶蛋白沉淀；用0.01摩尔、PH5.0的醋酸缓冲液透析，再加入0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓 冲液至十分之一的发酵液体积，即成粗酶液。
[0037] 上述所制备的人参原二醇类皂苷30克中加入90毫升甲醇和210毫升0.02摩尔、 PH5.0的醋酸缓冲液，搅拌溶解，再加入300毫升上述制备的粗酶液，在45°C搅拌反应30小 时。用TLC法检测，反应液中没有其他皂苷，90%以上为C-K皂苷。
[0038] c.提取反应液中皂苷，得到人参稀有皂苷C-K: 在反应液中加入2000毫升的甲醇混合，静止过夜使酶蛋白沉淀，离心分离酶蛋白沉淀， 加入210毫升缓冲液，即成回收酶，重复使用，酶回收率可达70~90%以上。
[0039] 酶蛋白沉淀分离得到的上清液，经预先处理好的700毫升体积的D-280大孔脱色树 脂柱脱色，再用1500毫升质量浓度80%的甲醇液洗脱树脂柱内的皂苷，其脱色液减压浓缩 (回收甲醇）后用300毫升水稀释，再经700毫升体积的大孔树脂柱(AB-8或HP-20树脂）反复 吸附皂苷，用4200毫升的去离子水洗脱柱中的糖类等杂质，然后用3500毫升的质量浓度85 ~90 %甲醇洗脱皂苷，减压浓缩，结晶、干燥，得16克反应产物人参稀有皂苷C-K，HPLC检测， 其纯度90%以上。
[0040] 上述反应中：从人参或者西洋参或者三七参根提取的人参二醇类皂苷(PPD)利用 含有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）的缓冲液（醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲 液），配制成人参二醇类皂苷的底物溶液;底物溶液的缓冲液pH为4.5~6.0，浓度为0.01~ 0.05M，有机溶剂质量浓度为5~40%;人参二醇类皂苷底物质量浓度为0.5~8%;将底物溶液 与粗酶液按照体积比1:0.1~1混合，在35~60°C反应16~40小时;所得产物几乎都是C-K皂 苷，加入反应液2~4倍体积的有机溶剂(丙醇、丙酮、乙醇或甲醇)沉淀酶蛋白、离心收集酶 蛋白，溶解在原酶液质量浓度70~80%的pH5的醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中， 即为粗酶液可重复使用。
[0041] 离心分离酶蛋白的上清，经脱色大孔树脂柱（柱体积，PPD皂苷原料重量的20倍体 积)脱色、减压浓缩、回收有机溶剂，其浓缩液经大孔树脂柱(柱体积，pro皂苷原料重的2〇倍 体积)反复吸附皂苷，用5~8倍柱体积的去离子水洗脱糖等杂质;再用4~6倍柱体积的质量 浓度80~96%的有机溶剂(丙醇、丙酮、乙醇或甲醇)洗脱皂苷，浓缩、结晶、干燥、同样得到纯 度90%以上的人参稀有皂苷C-K。
[0042] 实施例2: a. 以人参为原料，提取人参三醇类皂苷混合物同实施例1; b. 以人参三醇类皂苷混合物为原料，与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，再将底物 溶液与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应： 所述粗酶液按照如下常规方法制备： 米曲霉菌Aspergillus oryzae sp.39g(从大曲中分离得到；文献，王东明、鱼红闪等 Process Biochemistry2012, 47，133-138。大连工业大学菌种保藏所，保藏号： Aspergillus oryzae sp.39g)接种于装有灭菌过的水分50%的1公斤麦麸的曲匣中（含50克 人参粉），在28~32°C、培养4~7天(每天搅拌4~6次），然后用5升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸 缓冲液浸出酶;酶液离心，其上清液用硫酸铵固体沉淀酶蛋白；离心收集沉淀，溶解于500毫 升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液;即为粗酶液。
[0043]取实