人参稀有皂苷c-k、f1及四种异构体人参皂苷元的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人参稀有皂苷和四种异构体人参皂苷元的制备方法，尤其是一种 操作简单、成本低、得率及纯度高、适合大批量生产的人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人 参皂苷元的制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国目前产量高的人参主要为人参（Panax ginseng C.A.Mayer)、西洋参（P. quinguefolus L.)和三七参（P. notoginseng burk)。人参根的主要阜苷为Rbl、Rb2、Rb3、 此、1?(1、1^、1^1;西洋参的主要皂苷以肋1和1^为主，还含肋2、1^、1?(1、1^1皂苷 ;三七参的主要 皂苷以Rbl和Rgl为主，还含Rd、Re、Rl皂苷;其他皂苷含量较低。
[0003] 人参主要原人参二醇类(pro)皂苷结构如下：
注:Glc, β-D-吡喃葡萄糖基;Arap, α-L-吡喃阿拉伯糖基;Araf, α-L-咲喃阿拉伯糖 基;Xyl，i3-D_吡喃木糖基。
[0004] 红参中存在四种异构体的人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元（文献：Lars P. Christensen ed. Ginsenosides: Chemistry, Biosynthesis , Analysis , and Potential Health Effects. Advances in Food and Nutrition Research. (2009) Volume 55, p.1-99. Elsevier Inc·)。
[0005] 红参中存在的四种异构体的人参二醇皂苷元为20(s)-人参二醇皂苷元[20(S)_ prool]，20(R)_人参二醇皂苷元[20(R)-PPD01]，20-羟基脱的20(21) ,24-二烯人参二醇皂 苷元[PPD01(-H20)-20(21)，24-diene]，20_羟基脱水的20(22) ,24-二烯人参二醇皂苷元 [PPD01(-H20)-20(22),24-diene]； 人参稀有皂苷C-K和四种异构体的人参二醇皂苷元结构如下：
汪：Glc，P-U-TO_匍甸椐盎；肋a，a-L-TO_風字椐盎；Xy 1，P-U-TO_不椐盎。
[0006] 红参中存在的四种异构体的人参三醇皂苷元为20(S)_人参三醇皂苷元[20(S)_ PPTol ]，20(R)_人参三醇皂苷元[20(R)-PPT01 ]，20-羟基脱水人参三醇皂苷元-20(21)， 24-二烯[PPTol(-H20)-20(21)，24-diene]，20-羟基脱水人参三醇皂苷元-20(22)，24-二 烯[PPTol (-H20)-20(22)，24-diene]。上述人参皂苷元异构体，红参中极其微量存在。
[0007] 人参稀有皂苷F1和四种异构体的人参三醇皂苷元结构如下：
四种异构体的人参二醇皂苷元和四种异构体的人参三醇皂苷元的生理活性远高于人 参皂苷。
[0008] 人参口服后在肠道菌的作用下人参二醇类皂苷(Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd#W^SC-K， 人参三醇类皂苷(Re、Rgl)转化为F1，继而被吸收、起药效；因此，人参皂苷C-K和F1是吸收率 高、生理活性高的人参稀有阜苷（文献:]\ /11(3的〇1^，1'01^〇，1(1((^3811；[.]"1'^(1]\^(1· 1994 11， 241-245)。
[0009] 因此，大量制备高活性人参稀有皂苷c-κ和F1、四种异构体的人参二醇皂苷元和人 参三醇皂苷元，对人参制品、保键食品和化妆品以及药物开发意义很大。
[0010]为了得到高活性、容易吸收的的人参稀有皂苷，国际专利申请PCT/CN00/00744(中 国ZL0082112.9、欧洲EP1354944、美国发明专利US7,759，101B2、日本JP-4953547;文献2) 等，公开了从人参中含量高的仙1、仙2、1^、1?(1、1^和1^1酶转化制备1^2、1^3、(：-1(、1^2和1^1 等;所公开的人参皂苷酶来自细菌、霉菌、酵母菌、麦芽、人参植物、动物肝，按照水解皂苷糖 基位置不同，分为四种人参皂苷酶:人参皂苷酶I型，能水解人参二醇皂苷Rbl、Rb2、Rb3、Rc 等的3-0-(第三碳)糖基和20-0-糖基，逐步得到Rd-F2-C-K(或Rh2)等皂苷;人参皂苷酶II 型，能水解人参二醇皂苷Rbl、Rb2、Rb3、Rc等20-0-糖基，逐步生成Rd和Rg3;人参皂苷酶III 型，能水解人参皂苷Rd的3-0-糖基，生成C-Κ;人参皂苷酶IV型，能水解人参皂苷Re和Rg2的 6-0-糖基，生成Rgl和Rhl。
[0011] 如上所述可利用人参皂苷酶III型转化Rd单体皂苷制备C-K，但是Rd单体和人参皂 苷酶III纯酶成本太高，产业化难度大;其他二醇皂苷酶反应，虽然产生c-κ皂苷，但反应物 有很多其他皂苷副产物，不仅c-κ转化率低，而且还增加了产物中分离c-κ的步骤，操作麻 烦。
[0012] 论文（J. Microbiol. Biotechnol. 2011，21(10)，1057-1063)报道，来自米曲 霉的人参皂苷酶IV水解Re和R1皂苷的6-0-鼠李糖和木糖基变成Rgl，进一步水解Rgl的6-0-葡萄糖基变成F1皂苷，Rg2转化为Rhl和20 (S)-人参三醇苷元。
[0013] 论文（J. Microbiol. Biotechnol. 2012; 22，343~351;论文PLOS 0NE，2014， (9)，1-16，e96914 (Pos One: June 2014/ Volume 9/ Issue 6 /e96914,文献5)报道， 很多新发现的微生物的酶、转基因克隆得到的人参皂苷酶，能水解人参皂苷Rbl、Rb2、Rc、 RcURe 和 Rgl 的生成相应的低糖基稀有皂苷 F2、C-K、Fl、20(S)-Rg2、20(S)-Rg3、20(S)-Rhl、 20(S)-Rh2;但是这些酶反应产生很多副产物。
[0014] 日本小桥等（文献：M Kanaoke，T Okao，K Kobashi · J Trad Med · 1994 11， 241-245)报道，人参口服后在肠道菌的作用下人参二醇类皂苷Rbl等逐渐转化为Rd，F2，C-K、20(S)_二醇皂苷元;人参三醇类皂苷Re等逐渐转化为Rgl、Fl、20(S)_三醇皂苷元被吸收， 但其转化微弱。
[0015] 因此，现有技术所公开的酶转化法水解人参二醇类皂苷Rbl、Rb2、Rb3、RC、Rc^iJg C-κ皂苷或酶转化法水解人参三醇类皂苷Re、Rl、Rgl制备F1皂苷，均存在着副产物多，稀有 皂苷C-Κ或F1转化率低等缺点，且需要从众多副产物中分离提纯，操作麻烦、难度大;而且上 述酶反应只能微量地生成20 (S)-人参二醇皂苷元和20 (S)-人参三醇皂苷元，无法生产四种 异构体的皂苷元。
【发明内容】
[0016] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低、 得率及纯度高、适合大批量生产的人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方 法。
[0017] 本发明的技术解决方案是:一种人参稀有皂苷C_K、F1及四种异构体人参皂苷元的 制备方法，其特征在于按照如下步骤进行： a.以人参为原料，提取人参二醇类皂苷混合物和人参三醇类皂苷混合物； 具体可如下： 将人参、西洋参或三七参切碎，用8~10倍(重量/体积）甲醇或者70~80%乙醇在常温或 者30~50°C提取6~24小时，重复提取3次，合并提取液，减压浓缩至波美度20~24(回收有 机溶剂），得到浓缩液;将浓缩液用30~50%体积的石油醚脱脂2~3次，脱脂后人参提取液加 3~5倍体积的水稀释，大孔树脂柱(柱体积为人参重量的2倍体积）中反复吸附皂苷，用5~8 倍体积的去离子水洗脱除糖等杂质；然后用乙醇-水梯度洗脱树脂柱：乙醇浓度梯度为30% ~84%，洗脱剂总体积为柱体积的7~10倍。用TLC方法检测皂苷，分别收集原人参三醇类皂 苷洗脱液部分和原人参二醇类皂苷洗脱液部分;再分别减压浓缩（回收乙醇）、干燥，分别得 到原人参三醇类(PPT)皂苷和原人参二醇类(pro)皂苷。
[0018] 从人参提取的原人参二醇类皂苷经HPLC方法检测，主要含Rbl、Rb2、Rc、Rd，少量含 Rb3,原人参三醇类皂苷主要含Re和Rgl;从西洋参提取的原人参二醇类皂苷主要含Rbl、 仙2、此、1?(1，原人参三醇类皂苷主要含1^和1^1;从三七参提取的原人参二醇类皂苷主要含 Rbl、Rd，原人参三醇类皂苷主要含Rgl、Re、Rl。
[0019] b.分别以人参二醇类皂苷混合物或人参三醇类皂苷混合物为原料，与有机溶剂 及缓冲液配制成底物溶液，再将底物溶液与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应； c.分别提取反应液中皂苷，得到人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1。
[0020] 所述底物溶液中缓冲液的pH为4.5~6.0，浓度为0.01~0.05M，有机溶剂的质量浓 度为5~40%，人参二醇类皂苷混合物或人参三醇类皂苷混合物的质量浓度为0.5~8%;所述 缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，所述有机溶剂为丙醇、丙酮、乙醇或甲 醇。
[0021] 所述粗酶液是采用黑曲霉菌或者米曲霉菌液态发酵或者固态发酵，酶发酵培养基 的产酶诱导物是人参粉、人参总皂苷或槐花粉;对发