ml收集1管，检测收集管中的多糖含量， 绘制洗脱曲线，得到EPSI和EPS Π 两个洗脱峰，，分别收集，将收集液浓缩至多糖含量大约 lg/L，再用葡聚糖凝胶G-100柱层析，将收集液浓缩至多糖含量10-20g/L，再加3倍无水乙醇 沉淀，收集沉淀，冷冻干燥，共得到EPSI5.42g，EPS Π 1.86g。
[0085] 斜面培养基组成为（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,牛肉膏5,氯化钠3,琼脂20,调整 pH7.0-7.2,蒸馏水配制。
[0086]发酵用液体种子培养基组成（g/L)甘油20,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉6,硫酸 铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0087]发酵用培养基组成(g · Γ1):甘油60,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉3,硫酸铵2,调 整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0088] 实施例5假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01产胞外的抗氧化活性 [0089]收集菌株SFEP-01发酵液加水稀释30倍，8000r/min离心10min，收集上清液然后再 浓缩至原发酵液体积，加入3倍无水乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再离心收集沉淀，冷冻 干燥，得胞外多糖粗品。
[0090] 取上述制取的细菌胞外多糖粗品，加缓冲液溶解分散，过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离，得到EPSI和EPS Π 两个洗脱峰，再用葡聚糖凝胶G-100柱层析，将收集 液浓缩至多糖含量10_20g/L，再加3倍无水乙醇沉淀，收集沉淀，冷冻干燥，共得到EPSI、EPS Π 纯品。
[0091] 将上述制取的细菌胞外多糖粗品和EPSI、EPSΠ ，分别配制成溶液，以维生素 C为对 照测定多糖的还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力，结果显示多糖粗品和EPSI的还原 能力和清除超氧阴离子自由基的能力与维生素 C相当（见图8、图9)。
[0092] 上述多糖还原能力的测定方法:配制不同浓度的样品溶液，取25mL比色管，加入样 品溶液1. OmL，加入0.2M、pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL，加入1 %的铁氰化钾溶液2.5ml，混合 均匀，50 °C恒温水浴20min，取出冷水冷却，再加入10 %的三氯乙酸溶液2.5mL终止反应， 4000rpm离心取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和0.1 %的三氯化铁溶液0.5mL，混合均 匀，静置lOmin，以去离子水做对照，在700nm处测吸光度，吸光度值越大表示还原力越强。 以相同浓度的的维生素 C作为阳性对照。
[0093] 上述清除超氧阴离子自由基的能力的测定方法：配制不同浓度的样品溶液，取 25mL比色管，加入pH 8.0的50mMTris缓冲液4.5mL，加入样品溶液2mL，37°C恒温水浴lOmin， 再加入预温的7mM邻苯三酚0.2mL，混合均匀，继续在37 °C的恒温水浴4min，加入两滴浓盐酸 (10M)终止反应，在320nm处测吸光度。
[0094]清除率计算：
[0095] 清除率（％ )=[卜(Ab-Ac)/Aa] X 100%
[0096] Aa为不加样品，加入邻苯三酚时的吸光度；
[0097] Ab为加入样品和邻苯三酚的吸光度；
[0098] A。为加入样品不加邻苯三酚的吸光度。
[0099] 实施例5假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01发酵产胞外多糖
[0100]将28°C培养1天的菌种斜面接种液体种子培养基，25°C培养16小时，按体积比10% 的接种量接入到摇瓶发酵培养基中，30°C培养68小时，结束发酵。称取lg发酵产物，加水稀 释150倍，苯酚硫酸法测定的胞外多糖含量为llg/L。
[0101] 斜面培养基组成为（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,牛肉膏5,氯化钠3,琼脂20,调整 pH7.0-7.2,蒸馏水配制。
[0102] 发酵用液体种子培养基组成(g/L)甘油20,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉6,硫酸 铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0103] 发酵用培养基组成(g · Γ1):甘油60,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉3,硫酸铵2,调 整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0104] 实施例6假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01发酵产胞外多糖
[0105]将28 °C培养1.5天的菌种斜面接种液体种子培养基，28°C培养10小时，按体积比 10%的接种量接入到摇瓶发酵培养基中，28°c培养72小时，结束发酵。称取lg发酵产物，加 水稀释150倍，苯酚硫酸法测定的胞外多糖产率为11.85g/L。
[0106] 发酵用液体种子培养基组成(g/L)甘油20,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉6,硫酸 铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0107] 发酵用培养基组成(g · L-1):甘油80,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉5,硫酸铵1，调 整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0108] 应当理解的是，本发明的上述【具体实施方式】仅仅用于示例性说明或解释本发明的 原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨 在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修 改例。
【主权项】
1. 一种微生物胞外多糖的制备方法，包括： 1) 利用保藏编号为CCTCC No:M2016035的假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01发酵至 发酵液呈凝胶状，得胞外多糖发酵液； 2) 将步骤1)得到的胞外多糖发酵液加水稀释，离心，收集上清液，真空浓缩至原体积， 加乙醇进行醇沉，收集沉淀干燥后即获得胞外多糖粗品。2. 根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)中假单胞菌 (Pseudomonas sp. )SFEP_01发酵的方法包括步骤如下： ① 将假单胞菌SFEP-01接种于新鲜斜面菌种培养基上，25-30°C培养1-2天得活化菌体； ② 将步骤①制得的活化菌体接种于液体种子培养基中，25-30Γ培养8-24小时，得种子 液； ③ 将步骤②制得的种子液接种至发酵培养基，25-30°C发酵48 - 72小时至发酵液呈凝 胶状，得胞外多糖发酵液。3. 根据权利要求2所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，斜面菌种培养基为(g/L): 葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化钠2-5，琼脂粉15-20，pH值调至7.0-7.2; 液体种子培养基为(g/L):碳源10-60,酵母浸粉3-6,氯化钠2-5,玉米浆粉3-5,硫酸铵 1-2,调整pH 值 7.0-7.2; 发酵培养基为(g/L):碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2， 调整 pH 值 7.0-7.2。4. 根据权利要求2所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，液体种子培养基和产胞外 多糖发酵培养基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐等，优选为甘油。5. 根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤2)中，发酵液加水稀 释10-50倍，4000-8000r/min离心10-20min，收集上清液然后再40-60 °C浓缩至原发酵液体 积，加入1-3倍无水乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心或过滤收集沉 淀，低温干燥或冷冻干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。6. 根据权利要求1所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，还包括： 步骤3)取步骤2)制取的胞外多糖粗品，加缓冲液分散，经DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换柱分离，得到EPS I和EPS Π 两个组分，分别收集EPS I和EPS Π 适当浓缩后再分 别用葡聚糖凝胶G-100柱层析，获得SFEP-01菌株胞外多糖组分EPS I和EPS Π 纯品。7. 根据权利要求6所述的胞外多糖的制备方法，其特征在于，胞外多糖粗品，加300-500 倍缓冲液溶解分散形成胶体溶液； DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离条件为:将离子胶DEAE-Sepharose Fast Flow湿装柱，用0 · 05mol/L、pH为7 · 6的Tris-HCl溶液平衡，将粗多糖样品用0 · 05mol/L、pH为 7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度洗脱，洗 脱的流速为1-1.5BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并单一 峰收集管，透析、浓缩用于后续分离； 葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为:将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的 Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-Sepharose Fast Flow分离的单一组分浓缩上样，用相同的缓 冲液洗脱，洗脱流速l_2BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖 含量高的收集管，透析、浓缩、干燥。8.根据权利要求1-7任一项制备方法制备得到的胞外多糖。
【专利摘要】本发明公开了一种微生物胞外多糖及其制备方法，利用假单胞菌(Pseudomonas？sp.)SFEP-01进行胞外多糖的制备，发酵胞外多糖产率可达8-12g/L，所产胞外多糖具有极强的凝胶活性、抗氧化活性、还原能力和清除超氧阴离子自由基的能力，该菌株所产胞外多糖主要含有两种成分：EPS？Ⅰ和EPS？Ⅱ，EPS？Ⅰ为杂多糖，单糖残基为葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，EPS？Ⅱ为均一多糖，单糖残基为葡萄糖；所述菌株已于2016年1月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？No:M2016035。所述菌株和多糖均具有良好研究开发前景。CCTCC NO：M201603520160114
【IPC分类】C12P19/04
【公开号】CN105647990
【申请号】
【发明人】刘建军, 赵祥颖, 田延军, 赵晨, 张家祥, 王晓霞
【申请人】山东省食品发酵工业研究设计院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月14日