一种微生物胞外多糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物多糖领域，涉及一种微生物胞外多糖及其制备方法，具体涉及 一种假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01发酵制备的胞外多糖及其制备纯化方法。
【背景技术】
[0002] 微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式:①黏附在细胞表面上，即胞壁多糖;② 分泌到培养基中，即胞外多糖;③构成微生物细胞的成分，即胞内多糖;而其中的胞外多糖 具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产。
[0003] 微生物胞外多糖(Extracellular polysaccharides，EPS)是微生物在生长过程中 为适应周围环境的变化产生的一种对自身具有保护作用的生物高聚物。微生物胞外多糖和 植物多糖相比较具有以下优势:①生产周期短，不受季节、地域、病虫害等条件的限制;②具 有较强的市场竞争力和广阔的发展前景;③应用广泛。目前已有多种微生物胞外多糖已经 发展成为一类新型的发酵产品，作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、保湿剂、胶凝剂、悬浮剂等广 泛应用于石油、化工、食品和制药等多个领域。近年来有关海洋微生物和乳酸菌微生物胞外 多糖研究活跃，不断有新型多糖结构被鉴定。微生物多糖作为天然活性大分子，在生物医药 领域的潜在应用价值也日益受到人们的广泛关注。
[0004] 新菌种的进一步探索成为新型胞外多糖的一个重要来源。CN102816724B公开了一 株放射形根瘤菌，其产生主要由半乳糖和葡萄糖组成的胞外多糖，其胞外多糖水溶性好，且 在低浓度下具有良好的粘度、表面活性、蛋白质可混性以及良好的稳定性和乳化性。 CN102965318B公开了一种产胞外多糖的嗜热链球菌，该菌株在42°C条件下用M17培养液发 酵30小时产胞外多糖148mg/L，胞外多糖可明显提高发酵乳的粘度和凝胶强度。 CN104232548A公开了 一株假单胞菌，其合成的凝胶多糖为胞外多糖，将发酵条件优化，凝胶 多糖产量可达5.94g/L。
[0005] 此外，不同的微生物菌株往往产生不同类型的胞外多糖，不同的胞外多糖也具有 不同的结构和/性能。到目前为止，已大量投产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xanthan gum)、 结冷胶(Gellan g um)、小核菌葡聚糖(Sclee roglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、热凝多 糖(Curdlan)等。
[0006] 如何开发生产胞外多糖的新菌种、开发新型的胞外多糖以及提高胞外多糖的产 量，是微生物多糖领域技术人员面临的问题。
【发明内容】
[0007] 在现有技术已有开发微生物多糖的基础上，本发明提供一株高产细菌胞外多糖的 假单胞菌，并利用该菌株发酵制备胞外多糖及进行多糖纯化。该菌株能够转化甘油、葡萄 糖、淀粉、柠檬酸钠等产生凝胶型胞外多糖。
[0008] 发明人从海洋真菌发酵生产DHA的发酵培养污染物中采用常规方法分离筛选得到 一株高产胞外多糖的假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01，该菌株保藏于中国典型培养物 保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2016年1月14日，保藏编号为CCTCC N〇:M2016035,保藏地址： 中国武汉武汉大学，其具有如下生物学特征：
[0009]菌株SFEP-01菌落及形态特征：固体培养菌落圆形，凸起，边缘整齐，表面光滑，淡 黄色、半透明状;30°C培养24小时，菌落直径约1mm，培养48小时，菌落直径约3-5mm(菌落形 态见附图1，附图2);菌株SFEP-01为杆菌，不形成芽胞，菌体形态直或稍弯、两端形状不规 贝1J，大小0 · 5~0 · 8μπιX 1 · 5~3 · Ομπι(菌体形态见附图3)，液体培养12小时染色可见菌体外多 糖物质(见附图4)。
[0010] 菌株SFEP-01生理生化特征是:革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度28-30°C，在 25°C生长良好;利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，接触酶阳性;生理生化实验结果详见表1。
[0011] 表1菌株SFEP-01的部分生理生化特征
[0012]
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[0014] 注："+"生长良好或呈阳性；不生长或呈阴性。
[0015] 上述用于菌体形态观察的液体培养基组成（g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,氯化钠3， pH7.0-7.2,蒸馏水配制。
[0016] 上述用于菌落形态观察的固体培养基组成(g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,氯化钠3,琼 脂15-20，pH7.0-7.2，蒸馏水配制。
[0017] 上述形态特征观测的实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系统鉴定 手册》，科学出版社，2001，第一版，p353-363。
[0018]上述生理生化试验培养基及实验方法参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌系 统鉴定手册》，科学出版社，2001，第一版，p364-398。
[0019 ]以本发明的菌株SFEP-01的全基因组DNA为模板，采用细菌16 SrDNA通用引物PCR扩 增该菌株16S rRNA基因序列，扩增产物测序得到长度为1399bp的序列（如序列表SEQ ID NO: 1所不），使用美国生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比对，发现本发明的菌株SFEP-01 16S rRNA的基因序列与 NCBI注册的多株浅黄色假单胞杆菌(Pseudomonas luteola)和一些未被完全鉴定的假单胞 菌的16S rRNA的基因序列具有99%的同源性，生理生化试验结果与《常见细菌系统鉴定鉴 定手册》中浅黄色假单胞杆菌的特征符合度较高（参考东秀珠、蔡妙英等编著的《常见细菌 系统鉴定手册》科学出版社，2001，第一版，pl72)，系统发育树表明该菌株与已知浅黄色假 单胞杆菌亲缘关系与其他未鉴定假单胞杆菌菌株(Pseudomonas sp.)没有显著区别，因此， 将该菌株初步鉴定为假单胞菌菌种(Pseudomonas sp.)。
[0020] 发明人在发酵过程中发现，利用菌株SFEP-01发酵生产多糖，摇瓶发酵最终发酵液 因为多糖的产生呈固体凝胶状，说明本发明所述假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01发酵 产生多糖具有极强凝胶活性。
[0021] 本发明的一个目的在于提供一种微生物胞外多糖的制备方法，包括：
[0022] 1)利用假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01发酵至发酵液呈凝胶状，得胞外多糖 发酵液；
[0023] 2)将步骤1)得到的胞外多糖发酵液加水稀释，离心，收集上清液，真空浓缩至原体 积，加乙醇进行醇沉，收集沉淀干燥后即得胞外多糖粗品。
[0024] 其中，具体的，上述步骤1)中利用假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-〇l发酵的方 法包括步骤如下：
[0025]①将假单胞菌SFEP-01接种于新鲜斜面菌种培养基上，25-30°C培养1-2天得活化 菌体；
[0026]②将步骤①制得的活化菌体接种于液体种子培养基中，25-30°C培养8-24小时，得 种子液；
[0027]③将步骤②制得的种子液接种至发酵培养基，25_30°C发酵48 - 72小时至发酵液 呈凝胶状，得胞外多糖发酵液。
[0028] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01斜面菌种培养基为(g/L):葡萄糖20- 50，酵母浸粉2-5，氯化钠2-5，琼脂粉15-20，pH值调至7.0-7.2。
[0029] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01液体种子培养基为（g/L):碳源10- 60，酵母浸粉3-6，氯化钠2-5，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
[0030] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01发酵培养基为（g/L):碳源40-80,酵 母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
[0031 ] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01液体种子培养基和产胞外多糖发酵 培养基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐等，优选为甘油。
[0032] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01产胞外多糖发酵的培养温度优选为 28±2°C。
[0033] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01液体种子培养时间优选为12-14小 时。
[0034] 上述假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01产胞外多糖发酵培养时间优选为60-70小时。
[0035] 优选的，上述步骤2)中，发酵液(呈凝胶状)加水稀释10-50倍，4000-8000r/min离 心10-20min，收集上清液然后再40-60 °C真空浓缩至原发酵液体积，加入1-3倍无水乙醇，充 分混匀，静置沉淀，然后再经3000-5000r/min离心或过滤收集沉淀，低温干燥或冷冻干燥即 得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。
[0036]进一步的，本发明所述胞外多糖的制备方法，还包括：
[0037]步骤3)取按上述方法制取的SFEP-01菌株胞外多糖粗品，加缓冲液溶解分散，经 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离，收集洗脱液，经检测得到两个分离组分EPSI 和EPS Π ，分别收集EPSI和EPS Π ，适当浓缩后再分别用葡聚糖凝胶G-100柱层析，获得SFEP-01菌株胞外多糖组分EPSI和EPSII。
[0038] 优选的，胞外多糖粗品，加300-500倍缓冲液溶解分散形成胶体溶液。
[0039] DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-Sepharose Fast Flow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡，将粗多糖样品用0.05mol/ L、pH为7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度 洗脱，洗脱的流速为1