-1.5BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线， 合并单一峰收集管，透析、浓缩用于后续分离。
[0040] 葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为:将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为 7.6的Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-Sepharose Fast Flow分离的单一组分浓缩上样，用相同 的缓冲液洗脱，洗脱流速l_2BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，合并收集到的 多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥得到EPS I和EPS Π 纯品。
[0041 ] 分别对EPSI和EPS Π 进行酸水解，水解产物通过纸层析和HPLC分析显示，EPSI水解 产物含有葡萄糖、甘露糖、鼠李糖三种成分(见附图6)，EPS Π 水解产物中只有葡萄糖(见附 图7)。
[0042]经检测SFEP-01菌株胞外多糖具有抗氧化活性，还原能力和清除超氧阴离子自由 基的能力与维生素 C相当。
[0043]本发明取得了以下有益效果：
[0044] (1)本发明利用分离获得的假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01进行胞外多糖的 制备，利用甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉等可发酵产生凝胶型胞外多糖，经发酵条件适当优化 后，SFEP-01菌株发酵胞外多糖产率可达8-12g/L;
[0045] (2)本发明进一步分离纯化了假单胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01胞外多糖的组 分，该菌株所产细菌胞外多糖经鉴定主要含有两种成分:EPSI和EPSII，EPSI为杂多糖，单糖 残基为葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，EPS Π 为均一多糖，单糖残基为葡萄糖；
[0046] (3)本发明利用获得的假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP_01生产的胞外多糖具有 抗氧化活性，还原能力(见图8)和清除超氧阴离子自由基的能力(见图9)与维生素 C相当。
【附图说明】
[0047]图1假单胞杆菌SFEP-01菌株在平板上的培养24小时的菌落特征。
[0048]图2假单胞杆菌SFEP-01菌株在平板上的培养48小时的菌落特征。
[0049] 图3假单胞杆菌SFEP-01菌株在液体培养基中培养12小时的菌体特征。
[0050] 图4假单胞杆菌SFEP-01菌株在液体培养基中培养24小时的菌体特征。
[0051 ] 图5假单胞杆菌SFEP-01菌株产胞外多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换 柱分离洗脱曲线。
[0052]图6假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖EPSI水解后HPLC谱图。
[0053]图7假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖EPS Π 水解后HPLC谱图。
[0054]图8假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖粗品及EPSI、EPSII还原能力的测定 [0055]图9假单胞杆菌SFEP-01菌株所产胞外多糖粗品及EPSI、EPSII清除超氧阴离子自 由基的能力的测定
【具体实施方式】
[0056]实施例1菌株的分离
[0057] 发明人在进行海洋真菌发酵生产DHA的过程中发现染菌现象，逐进行污染菌种分 离，获得SFEP-01菌株，进一步研究发现该菌株可以利用常见碳源产生大量胞外多糖，经生 理生化鉴定和16S rDNA测序分析，鉴定该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
[0058] 实施例2碳源对假单胞菌SFEP-01菌株产细菌胞外多糖的影响
[0059]将28°C培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，28°C培养14小时，按体积比 5%的接种量接入到添加不同碳源的摇瓶发酵培养基中，28°C培养68小时，结束发酵。称取 lg发酵产物，加水稀释150倍，稀释液采用苯酚硫酸法测定的胞外多糖产率。SFEP-01菌株利 用不同碳源胞外多糖的产量见表2.
[0060] 表2碳源对SFEP-01菌株产胞外多糖的影响
[0061]
[0062]斜面培养基组成为（g/L):葡萄糖2,蛋白胨10,牛肉膏5,氯化钠3,琼脂20,调整 pH7.0-7.2,蒸馏水配制。
[0063]发酵用液体种子培养基组成（g/L)葡萄糖20,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉6,硫 酸铵2，调整pH值7.0-7.2，自来水配制。
[0064]发酵培养基组成(g · Γ1):碳源60,酵母浸粉5,氯化钠3,玉米浆粉3,硫酸铵2,调整 pH值7.0-7.2,自来水配制。。
[0065]实施例3假单胞菌SFEP-01发酵胞外多糖的分离纯化及定性鉴定 [0066]利用SFEP-01菌株发酵生产细菌胞外多糖的方法：
[0067] 取25-30 °C培养1-2天的新鲜斜面接种液体种子培养基，25-30 °C培养8-24小时，接 种摇瓶发酵培养基，25-30°C摇瓶发酵48 - 72小时至发酵液呈凝胶状。适量称取发酵产物 (因为发酵结束时，发酵液呈凝胶状，因此取样采用称重方式），采用苯酚硫酸法测定其多糖 含量。
[0068] SFEP-01菌株产细菌胞外多糖的粗多糖的制取：
[0069] 发酵结束后，发酵液(呈凝胶状)加水稀释10-50倍，4000-8000r/min离心10min，收 集上清液然后再浓缩至原发酵液体积，加入3倍无水的乙醇，充分混匀，静置沉淀，然后再经 3000-5000r/min离心或过滤收集沉淀，低温干燥或冷冻干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗 品。
[0070] 假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01斜面菌种培养基为(g/L):葡萄糖20-50， 酵母浸粉2-5，氯化钠2-5，琼脂粉15-20。pH值调至7.0-7.2。
[0071] 假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01液体种子培养基为(g/L):碳源10-60,酵 母浸粉3-6，氯化钠2-5，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
[0072] 假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )SFEP-〇l产胞外多糖发酵培养基为(g/L):碳源40- 80，酵母浸粉3-6，氯化钠5-8，玉米浆粉3-5，硫酸铵1-2，调整pH值7.0-7.2。
[0073] 假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01液体种子培养基和产胞外多糖发酵培养 基中，碳源可选甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、柠檬酸盐等，优选为甘油。
[0074] 假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01所产细菌胞外多糖分离纯化及定性鉴定：
[0075]取按上述方法制取的SFEP-01菌株所产细菌胞外多糖粗品，加300-500倍缓冲液溶 解溶解分散形成胶体溶液，经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离，得到两个组分 EPSI和EPSII(见附图5)，分别收集EPSI和EPSII适当浓缩后再分别用葡聚糖凝胶G-100柱层 析，结果仍为单一组分。将收集的EPSI和EPSΠ ，分别进行酸水解，水解产物通过纸层析和 HPLC分析显示，EPSI水解产物含有葡萄糖、甘露糖、鼠李糖三种成分(见附图6 )，EPS Π 水解 产物中只有葡萄糖(见附图7)。
[0076] DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离条件为：将离子胶DEAE-Sepharose Fast Flow湿装柱，用0.05mol/L、pH为7.6的Tris-HCl溶液平衡。将粗多糖样品用0.05mol/ L、pH为7.6Tris-HCL缓冲液溶解分散溶解后上样，用1.2mol/L的氯化钠溶液进行线性梯度 洗脱，洗脱的流速为1-1.5BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，绘制洗脱曲线， 合并单一峰收集管，透析、浓缩用于后续分离。
[0077]葡聚糖凝胶G-100柱分离条件为:将葡聚糖凝胶G-100湿装柱，用0.05mol/L、pH为 7.6的Tris-HCL溶液平衡，将DEAE-Sepharose Fast Flow分离的单一组分浓缩上样，用相同 的缓冲液洗脱，洗脱流速l_2BV/hr，每管收集5mL，检测收集管中的多糖含量，合并收集到的 多糖含量高的收集管，透析、浓缩、干燥，用于多糖水解定性分析。
[0078] SFEP-01菌株发酵液中多糖含量以及柱层析收集液中的多糖含量的采用苯酚硫酸 法测定，具体操作方法参考《复合多糖生化研究技术》(张惟杰.复合多糖生化研究技术[M]. 上海:上海科学技术出版社.1987. )p6。
[0079] EPSI和EPSII酸水解方法参考《复合多糖生化研究技术》(张惟杰.复合多糖生化研 究技术[M].上海:上海科学技术出版社.1987. )pl57
[0080] 水解产物纸层析分析方法参考《复合多糖生化研究技术》(张惟杰.复合多糖生化 研究技术[M].上海:上海科学技术出版社.1987. )ρ10
[0081 ] 水解产物HPLC分析方法:进样浓度110-50g/L。色谱柱:Hypersil APS-2(4.6mmX 250mm，5μηι);流动相：乙腈:水= 80:20(V/V);流速:0 · 5mL/min;进样量：1 OuL;柱温：30 °C。 [0082] 实施例4假单胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP_01产胞外多糖的制备 [0083]将28°C培养1-2天的菌种斜面接种液体种子培养基，28°C培养14小时，按体积比 5%的接种量接入到添加不同碳源的摇瓶发酵培养基中，28°C培养68小时，结束发酵。收集 发酵液(凝胶状)约1L，苯酚硫酸法测多糖含量为10.85g/L，加水稀释50倍，6000r/min离心 lOmin，收集上清液然后再浓缩至原发酵液体积约1L，加入3倍95%的乙醇，充分混匀，静置 沉淀，然后再经3000-5000r/min离心，收集沉淀，冷冻干燥，得胞外多糖粗品8.32g。
[0084] 取上述制取的细菌胞外多糖粗品，加300倍缓冲液溶解分散，分次（每次上样量 20ml)上样过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱分离（3.5 X40)，用1 · 2mol/L的氯化钠 溶液进行线性梯度洗脱，洗脱的流速为1.5BV/hr，5