培养基中，28°C，180rpm振荡培养过 夜。取lmL液体培养物扩繁至100mL含有上述抗生素，且另外附加了 lOmMMES和20μΜ乙酰丁香 酮的LB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养过夜。室温，5000rpm转速，离心收集菌体，将菌 体重悬在含有100mM MES、10mM MgCl2、200uM乙酰丁香酮的MS液体培养基中。利用分光光度 计调整浓度为〇〇6〇〇=1.5，在黑暗处放置311(^1^1、了1^2农杆菌侵染液的制备与了1^2-CrylAb/Ac相同。将制备好的TRV1分别与TRV2和TRV2-CrylAb/Ac农杆菌侵染液等体积混匀， 制成对照侵染液和实验侵染液，分别加入0.2wt%的表面活性剂Silwet L-77。将GA3预培养 后的棉花幼胚分别浸入上述制备好的对照侵染液（TRV1和TRV2)和实验侵染液（TRV1和 TRV2-Cry 1 Ab/Ac)中，25 °C，120rpm/min，暗培养30分钟，对棉花幼胚进行接种。
[0074] 接种后的培养:接种后，将幼胚放在灭菌滤纸上，吸去多余侵染液。在培养皿中铺 放5层灭菌滤纸，用含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基浸湿滤纸，将幼胚平铺在培养皿 中，25°C暗培养2天。将长出胚根的幼胚移栽到经过高温灭菌的培养土里，23°C，光照时间为 14/10h光暗周期的气候室中培养。培养期间，需保持环境温度不超过26°C。
[0075] (4)分子检测：
[0076] CrylAb/Ac蛋白的ELISA检测：培养2月后，用ENVIR0L0GIX公司的QualiPlate Kit for CrylAb/CrylAc试剂盒检测棉株种的BT蛋白含量。实验步骤如下：
[0077] 分别取对照组和实验组棉株(每组10株）的倒3叶，约0.15克，记录重量，用液氮研 磨，研细的粉末加到4mL样品提取液PBST(PBS缓冲液加入0.05wt%的Tween-20)中，4°C过夜 提取。
[0078] 4°C，8000rpm，离心10min，将上清液转至干净离心管，测量上清液体积。将上清液 稀释到合适的浓度，备用。取50ul CrylAb/Ac Enzyme conjugate加入酶标板中，再加入 50ul稀释后的上清液。为制作标准曲线，加入50ul试剂盒提供的Cry 1 Ab/Ac Positive control。每样品3重复。常温避光孵育2h。用PBST洗板4次。加入substrate显色底物100μΙ， 常温避光反应15_30min，加入stop solution反应终止液100μ1，用酶标仪测定450nm的0D 值，换算为BT蛋白的含量(单位为ng/g鲜重）。结果见图3。实验组(VIGS)叶片BT蛋白的含量 明显低于对照组(CK)，说明VIGS病毒侵染棉花幼胚后，可有效诱发转录后基因沉默，导致BT 蛋白含量降低。
[0079] 对比例
[0080] 选用完全平展的子叶作为侵染对象，利用注射器渗透子叶法，接种TRV病毒诱发棉 花GhCLAl基因沉默。侵染载体的制备和侵染液的制备同实施例1。
[0081] 选择发育成熟、颗粒饱满的棉种200粒，浸入水中，28°C培养过夜催芽。将棉种播种 到培养土中。28°C，光照/黑暗14/10h周期，培养10~20天。待子叶完全平展后，用注射器针 尖轻轻划破子叶背面表皮，利用lmL注射器将配置好的农杆菌侵染液压渗入子叶中。侵染后 的棉苗用塑料膜覆盖保湿，放置在25°C培养室中，暗培养1~2天。随后，对侵染后的棉苗进 行正常培养。培养2周后，观察棉苗白化的情况。
[0082] 同时，选择发育成熟、颗粒饱满的棉种200粒，利用本发明的方法，对幼胚为受体进 行VIGS基因沉默实验。
[0083]自棉种28°C浸水催芽始(记做第一天），对两种方法的接种时间等进行对比。结果 如表1所示。
[0084] 表1不同受体的比较
[0085]
[0086] 由表1可以看出，本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，不对幼胚进行破 坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点;采用浸泡幼胚 接种方式，操作简单，有效缩短接种时间。
【主权项】
1. 一种以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导棉花基因沉默的方法，其特征在于，步骤如 下： (1) 将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农 杆菌； (2) 取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有2.5 ~3 · 5mg/L GA3 (赤霉素）的MS液体培养基中，25~30 °C，120rpm/min暗培养6~10h，制得待 侵染胚； (3) 培养步骤（1)制得的转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液 质量百分比0.15~0.25%的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染 液中，22~28°C，100~150rpm/min，暗培养20~40分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种 到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中的目的基因为棉花GhCLAl基 因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中的重组载体，为将目的基因用 限制性内切酶EcoRI和ΚρηΙ双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和Kpra酶切后的 TRV病毒载体中； 优选的，所述步骤(1)中的转化为冻融法转化。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中的病毒载体TRV载体系统，包 含TRV1和TRV2载体;农杆菌为农杆菌GV3101。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中脱绒为采用浓硫酸脱绒，灭菌 为采用质量浓度为15%的双氧水浸泡0.5~1.511; 优选的，所述步骤(2)中萌发为在灭菌水中25~30 °C浸泡15~18h。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌侵染液的制备步骤如 下： 将转化后的农杆菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg//L庆大霉素、50mg//L利福平的LB 固体培养基上，25~30 °C暗培养2~3天;挑取单克隆接入含有相同浓度抗生素的LB液体培 养基中，25~30°C振荡过夜培养，制得液体培养物； 取lmL液体培养物扩繁至100mL含有上述相同浓度抗生素且含有10mM的MES和20μΜ乙酰 丁香酮的LB液体培养基中，25~30°C过夜培养;25°C，4500rpm离心菌体，将菌体重悬在含有 10mM MgCl2，10mM 2-(N-吗啉）乙磺酸，200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基中，调整OD6〇〇 = 1.5，22~28°C，暗处理2.5~3h，制得农杆菌侵染液。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中表面活性剂为Silwet L-77。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中共培养为在共培养培养基中 于22~28 °C暗培养2~3天;共培养培养基为含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基。9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基 为将200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基浸润4~7层滤纸制得。10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中营养土培养为将生根后的幼 苗在22~25°C，14h光照/10h黑暗的条件下，与营养土中培养，即可。
【专利摘要】本发明涉及一种以棉花幼胚为受体接种TRV病毒诱导内源基因沉默的方法，步骤如下：(1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后的农杆菌；(2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含有赤霉素的MS液体培养基中，制得待侵染胚；(3)培养转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，制得侵染液，将待侵染胚浸入侵染液中，暗培养，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，不对幼胚进行破坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点。
【IPC分类】C12N15/83
【公开号】CN105647966
【申请号】
【发明人】张景霞, 张军, 王芙蓉, 陈煜 , 张传云, 刘国栋
【申请人】山东棉花研究中心
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月17日