一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导基因沉默方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种以棉花幼胚为受体接种trv病毒诱导内源基因沉默的方法，属于 植物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 陆地棉全基因组测序已完成，产生海量DNA序列信息，深入研究这些序列的功能尤 为迫切。传统的基因功能研究手段主要以遗传转化为基础，但棉花的转化效率低，转化过程 繁琐且对受体基因型的依赖性较强，严重限制棉花功能基因组研究的发展。
[0003] 病毒介导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)是一种快速、高效、 高通量的反向遗传学技术，其原理是利用重组病毒抑制植物内源基因的表达，通过表型及 生理数据的分析鉴定基因功能。VIGS技术克服传统研究方法需要依赖遗传转化的局限性， 近几年在棉花基因功能研究中得到广泛应用。其中，烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV)载体是棉花中应用最为广泛VIGS载体。虽然VIGS沉默起效快、效率高，但该技术 在具体实验操作中的不足之处亦很明显，如接种病毒的方式多利用注射器渗透子叶或摩擦 破坏叶表皮接种，对棉苗造成损伤;接种时间一般在子叶完全平展后，因此，不能用来研究 发育较早期的基因功能;接种病毒时所需农杆菌侵染液制备量大，实验成本高;接种过程耗 时长等。对VIGS技术体系中的不足之处进行改良，可使该技术在棉花基因功能研究中发挥 更大作用。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种无损伤、沉默时间更早、成本更低、操作更 简便的转化方法，即以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导基因沉默的方法。
[0005] -种以棉花幼胚为受体的TRV病毒诱导基因沉默的方法，步骤如下：
[0006] (1)将目的基因插入TRV病毒载体中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化后 的农杆菌；
[0007] (2)取棉花种子，经脱绒、灭菌后，经萌发后去除萌发种子的内、外皮，幼胚放入含 有2.5~3.5mg/L GA3(赤霉素）的MS液体培养基中，25~30°C，120rpm/min暗培养6~10h，制 得待侵染胚；
[0008] (3)培养步骤（1)制得的转化后的农杆菌，制得农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵 染液质量百分比0.15~0.25%的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入 侵染液中，22~28°C，100~150rpm/min，暗培养20~40分钟，去除多余侵染液，经共培养后， 栽种到灭菌的营养土中，进行营养土培养，即可。
[0009] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的目的基因为棉花GhCLAl基因，核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0010] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的重组载体，为将目的基因用限制性内切酶 EcoRI和ΚρηΙ双酶切后，连接入同样经限制性内切酶EcoRI和Κρη頂每切后的TRV病毒载体中。
[0011] 根据本发明优选的，所述步骤(1)中的转化为冻融法转化。
[0012] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的病毒载体TRV载体系统，包含TRV1和TRV2载 体;农杆菌为GV3101。
[0013] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中脱绒为采用浓硫酸脱绒，灭菌为采用质量浓度 为15 %的双氧水浸泡0.5~1.5h，然后用大量的无菌水冲洗。
[0014] 根据本发明优选的，所述步骤(2)中萌发为在灭菌水中25~30 °C浸泡15~18h。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中农杆菌侵染液的制备步骤如下：
[0016] 将转化后的农杆菌涂布在含有50mg/L卡那霉素、50mg//L庆大霉素、50mg//L利福平 的LB固体培养基上，25~30°C暗培养2~3天;挑取单克隆接入含有相同浓度抗生素的LB液 体培养基中，25~30°C振荡过夜培养，制得液体培养物；
[0017] 取lmL液体培养物扩繁至100mL含有上述相同浓度抗生素且附加了 10mM的MES和20 μΜ乙酰丁香酮的LB液体培养基中，25~30°C过夜培养;25°C，4500rpm离心菌体，将菌体重悬 在含有10mM MgCl2，10mM MES(2-(N-吗啉）乙磺酸），200μΜ AS(乙酰丁香酮）的MS液体培养 基中，调整〇D6Q() = 1.5，22~28°C，暗处理2.5~3h，制得农杆菌侵染液。
[0018] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中表面活性剂为Silwet L-77。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中共培养为在共培养培养基中于22~28 °C暗培 养2~3天;共培养培养基为含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基；
[0020] 进一步优选的，所述含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基为将200μΜ乙酰丁香酮 的MS液体培养基浸润4~7层滤纸制得。
[0021] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中营养土培养为将生根后的幼苗在22~25°C， 14h光照/10h黑暗的条件下，与营养土中培养，即可。
[0022] 上述MS液体培养基，每升组分如下：
[0023] NH4NO3 1650mg、KN03 1900mg、KH2P〇4 170mg、CaCl2 · 2H20 440mg、MgS〇4 · 7H20 440mg、FeS〇4*7H20 27.85mg、Na2-EDTA 37.25mg、MnS〇4*4H20 22.3mg、ZnS〇4*7H20 8.6mg、H3B〇3 6.2mg、KI 0.83mg、Na2Mo〇4*2H2〇 0.25mg、CuS〇4*5H2〇 0.025mg、CoCl2*6H2〇 0.02511^、肌醇10〇11^、盐酸硫胺素(￥131)1〇11^、盐酸吡咳醇(￥136)111^、烟酸111^。
[0024] LB固体培养基，每升组分如下：
[0025] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl 10g、10g/L琼脂粉，pH = 7.0;高压蒸汽灭菌 20min〇
[0026] LB液体培养基，每升组分如下：
[0027] 胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl 10g，pH=7.0;高压蒸汽灭菌20min。
[0028] 有益效果
[0029] 1、本发明首次以棉花幼胚作为受体接种TRV病毒，诱导基因沉默;该方法不对幼胚 进行破坏性处理，不产生任何损伤，克服了接种病毒时对棉苗造成机械损伤的缺点；
[0030] 2、本发明采用浸泡幼胚接种方式，操作简单，有效缩短接种时间；
[0031] 3、采用本发明的技术对棉花进行基因沉默实验，第一片真叶即可发生基因沉默， 可用于棉花发育早期基因的功能研究。
【附图说明】
[0032]图1是侵染后的棉苗生长2个月时的白化表型照片；
[0033]图中：左图为GhCLAl基因沉默棉株，叶片和茎部可见明显的白化表型；右图为对 照，未出现白化现象；
[0034]图2是一步法RT-PCR检测沉默植株不同组织中病毒RNA的累积情况的电泳检测结 果照片；
[0035] RT-PCR结果显示，在侵染苗的根、莖、叶、子叶中均能扩增出明亮的特异性条带，说 明TRV病毒可全株扩散，未接种病毒的对照株中未扩增出任何产物。
[0036] 图3是利用QualiPlate Kit for CrylAb/CrylAc试剂盒检测棉株中BT蛋白的含量 的柱状图。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0038] 生物材料来源：
[0039] TRV载体的构建参考Xiquan Gao等论文Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton(Journal of visualized experiments,8/20/2011, URL:http://www. jove· com/details .php?id = 2938)中的内容进行制备；
[0040] 供试棉花品种为C〇ker312和鲁棉研37号，购自临清鲁壹种业有限公司；
[0041]农杆菌GV3101感受态购自华越洋生物科技有限公司；
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