042] 实施例1
[0043] 棉花GhCLAl基因 （cloroplastos alterados 1 gene)编码l_deoxyxylulose5-phosphate合成酶，参与叶绿体发育过程。GhCLAl基因沉默产生明显的白化表型，在VIGS体 系中被广泛用作基因沉默的标记性状。本实施例中，以幼胚为受体接种TRV病毒诱导棉花 GhCLAl基因沉默，具体方法如下：
[0044] (1)将目的基因插入病毒载体TRV2中，制备重组载体，然后转化农杆菌，制得转化 后的农杆菌：
[0045] 目的基因的制备:提取棉花叶片总RNA，反转录后获得cDNA，用GhCLAl基因特异引 物（FI:5，-GCGGAATTCCACAACATCGATGATTTAG-3'；R1:5 '-CGGGGTACCATGATGAGTAGATTGCAC-3'）扩增GhCLAl基因中约400bp的片段。
[0046] 所述PCR扩增体系为(总体积50μ1): TaKaRa Ex Taq (5 U/μ 1) 0* 25 μ 1
[0047] ΙΟΧΕχ Taq Buffer (Μ：β2+Ρ1υδ) 5 μL dNTP Mixture (各 2· 5 πΜ) 4： μL cDNA 1 μ 1 FI primer 1 μ 1
[0048] R1 primer 1 μ 1 DDW 37. 75 μ 1;
[0049] 所述PCR扩增程序如下：
[0050] 95°C 预变性 3min;95°C 变性 3〇8,59°(：退火3〇8,72°(：延伸4〇8,32个循环；72°(：延伸 10min〇
[0051 ] 病毒载体TRV2-GhCLAl的构建与农杆菌转化:将棉花GhCLAl基因中的400bp左右片 段用EcoRI和ΚρηΙ限制性内切酶酶切后，连入同样酶切的病毒载体TRV2中，构建了1^2-G h C L A1重组载体，利用冻融法转化农杆菌G V 3101; T R V1载体利用同样方法转化农杆菌 GV3101〇
[0052] (2)无菌幼胚的制备与预培养：
[0053]选取饱满、种子活力高的棉种用浓硫酸脱绒，大量流水冲洗干净，直至没有酸味。 用15 %的双氧水浸泡棉种lh，期间晃动5次。灭菌水冲洗6次，浸泡在无菌水中2h，再用灭菌 水冲洗3次，28°C浸泡18h。种子萌发后，无菌环境下将棉种的内、外种皮剥去，注意不要损伤 子叶和胚根，放入含有3mg/L GA3的MS液体培养基中，28°C，120rpm/min暗培养8h。
[0054] (3)接种病毒及培养：
[0055] 培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制备农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液 质量百分比0.2%的表面活性剂Silwet L-77,制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入 侵染液中，28°C，120rpm/min，暗培养20分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的 营养土中，进行营养土培养，即可。
[0056] 侵染液的制备与接种:将步骤(1)中经TRV2-GhCLAl和TRV1转化后的农杆菌菌种涂 布在含50mg/L卡那霉素、50m g//L庆大霉素、50mg//L利福平的LB固体培养基上，28 °C暗培养2 天。挑取单克隆，接种到5mL含有相同抗生素的LB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养过 夜。取lmL液体培养物扩繁至100mL含有上述抗生素，且另外附加了 lOmMMES和20μΜ乙酰丁香 酮的LB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养过夜。25°C，5000rpm转速，离心收集菌体，将菌 体重悬在含有100mM MES、10mM MgCl2、200yM乙酰丁香酮的MS液体培养基中。利用分光光度 计调整浓度为〇D6QQ = 1.5，在黑暗处放置3h。TRV1农杆菌侵染液的制备与TRV2-GhCLA 1相同。 将制备好的TRV1和TRV2-GhCLAl农杆菌侵染液等体积混匀，加入0.2wt%的表面活性剂 Silwet L-77。将用GA3预培养后的棉花幼胚浸入上述制备好的农杆菌侵染液中，25°C， 120rpm/min，暗培养30分钟，对棉花幼胚进行接种。
[0057] 接种后的培养:接种后，将幼胚放在灭菌滤纸上，吸去多余侵染液。在培养皿中铺 放5层灭菌滤纸，用含有200μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基浸湿滤纸，将幼胚平铺在培养皿 中，25°C暗培养2天。将长出胚根的幼胚移栽到经过高温灭菌的培养土里，23°C，光照时间为 14/10h光暗周期的气候室中培养。培养期间，需保持环境温度不超过24°C。
[0058] (4)沉默株的表型观察与分子检测：
[0059]培养18天，棉株刚长出的真叶和茎即可出现明显的白化表型，该表型可持续4~5 个月（如图1所示）。分别提取白化植株的子叶、真叶、莖和根的总RNA，利用TRV2载体中的特 异性序列设计引物 02:5'-TGGAGTTGAAG ACTTATTACCGAAGG-S' 42:5^ CCGGAATTCGAAACTCAAATGCTACCAA-3'），进行一步法RT-PCR，检测接种后病毒RNA的累积情 况。
[0060] RT-PCR结果显示，在子叶、真叶、茎和根组织提取的RNA样品中，均能扩增出明亮的 特异性条带，而在未接种的对照株中没有任何扩增产物。RT-PCR的结果说明，对棉花幼胚进 行接种后，病毒RNA可在棉苗不同部位扩散累积(如图2所示）。
[0061 ] 实施例2
[0062] (1)将目的基因 CrylAb/Ac插入病毒载体TRV2中，制备重组载体，然后转化农杆菌， 制得转化后的农杆菌：
[0063] 目的基因的制备:利用CrylAb/Ac基因特异引物PCR扩增转基因抗虫棉（鲁棉研37 号）中的CrylAb/CrylAc基因（基因序列如SEQ ID勵.2所示）中的44(^?左右的片段。所用引 物为 F3(5,-CCGGAATTCAACAGCGCCTTGACCACAGC-3,)和 1^3(5^ CGGGGTACCGGGCAGAACCACGGAAGC-3'）。
[0064] 所述PCR扩增体系如下（总体系50μ1): TaKaRa Ex Taq (5 U/ μ 1 )： Θ. 25 μ 1 ΙΟΧΕχ Taq Buffer (Mg2+Plus) 5 μL dNTP Mixture (各 2. 5 ηιΜ) 4 μ ?
[0065] cDNA 1 μL F2 primer 1 μ 1 R2 primer 1 μ 1 DDf 37.75 μ 1
[0066] 所述PCR扩增程序如下：
[0067] 95 °C 预变性 3min; 95 °C 变性 30s，60 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s，32 个循环；72 °C 延伸 10min〇
[0068] 载体的构建与转化:将制备的CrylAb/CrylAc基因片段经EcoRI和Kpnl双酶切后连 入同样双酶切的病毒载体TRV2中，制备重组载体TRV2-CrylAb/Ac，利用冻融法转化农杆菌 GV3101，制得转化后的农杆菌。未经改造的TRV1载体同样利用冻融法转化农杆菌GV3101，作 为阳性对照；
[0069] (2)无菌幼胚的制备与预培养：
[0070] 选取饱满、种子活力高的棉种用浓硫酸脱绒，大量流水冲洗干净。用15%的双氧水 浸泡棉种lh，期间晃动4次。灭菌水冲洗6次，浸泡在无菌水中2h，再用灭菌水冲洗5次，在灭 菌水中28°C浸泡18h。种子萌发后，无菌环境下将棉种的内、外种皮剥去，注意不要损伤子叶 和胚根，放入含有3mg/L GA3植物激素的MS液体培养基中，28°C，120rpm/min暗培养8h。
[0071] (3)接种病毒及培养：
[0072] 培养步骤(1)制得的转化后的农杆菌，制备农杆菌侵染液，然后加入农杆菌侵染液 质量百分比0.2%的表面活性剂，制得侵染液，将步骤(2)制得的待侵染胚浸入侵染液中，25 °C，120rpm/min，暗培养30分钟，去除多余侵染液，经共培养后，栽种到灭菌的营养土中，按 常规方法培养即可。
[0073] 侵染液的制备与接种:将步骤(1)中经TRV2_GhCLAl和TRV1转化后的农杆菌菌种涂 布在含50mg/L卡那霉素、50m g//L庆大霉素、50mg//L利福平的LB固体培养基上，28 °C暗培养2 天。挑取单克隆，接种到5mL含有相同抗生素的LB液体